تاریخچه PCR

مانند بعضی از کشف های بزرگ در علوم از پنیسیلین گرفته تا اجاق های ماکروویو، PCR نیز به صورت غیر منتظره و با خوش شانسی کشف شده است. به کمک بسیاری از دانشمندان از جمله Watson و Crick، Korenberg، Khorana ،Klenow ، Kleppe و Sanger تمام مواد اولیه برای انجام PCR تا سال ۱۹۸۰ شناسایی شده بود. مانند کره، آرد، تخم مرغ و شکر که بر روی میز آشپزخانه آماده مخلوط شدن و تولید کیک باشند، مواد اولیه PCR نیز منتظر کسی بودند تا آنها را مخلوط کرده و دانشمندان را با کاربردهای فراوان این تکنیک شگفت زده کند.

پدر PCR

Kary B. Mullis که برای شرکت Cetus در زمینه بهینه سازی سنتز الیگونوکلئوتیدها کار می کرد، جایزه نوبل شیمی سال ۱۹۹۳ را ( به همراه Miscael Smith) برای کار بر روی PCR و اختراع آن به دست آورد. مانند بسیاری از نوآوری ها و اختراعات بزرگ که بعد از مدتی اهمیت آنها شناخته می شود، زمان زیادی گذشت تا دانشمندان به اهمیت PCR پی بردند.

هنگامی که Mullis برای اولین بار روش کار اولیه و نظریه به کار رفته در PCR را در یک کنفرانس مطرح نمود، هیچکس تصور درستی از محصول نهایی در سر نداشت. بازخورد اولیه این نظریه ایجاد هرج و مرج در کنفرانس هنگام پاسخگویی به سوالات و برداشتن او از ریاست آزمایشگاه سنتز الیگونوکلئوتید بود. مجله Science مقاله او را فقط به خاطر اسم روش رد کرد اما سه سال بعد به پاس کارهای او آنزیم Taq پریمراز را مولکول سال نام نهاد.

به کمک همکاری با آزمایشگاه Erlich، پروژه PCR به خط تولید بازگشت و در چند سال آینده بهینه سازی هایی بر روی آن صورت گرفت. برای PCR کاربرد های متعددی شناخته شد که  از آن جمله می توان به انگشت نگاری DNA در ۱۹۸۶، سیستم تکثیر ژنی (۱۹۸۸)، real-time PCR به وسیله اتیدیوم بروماید (۱۹۹۲) و توالی یابی ژنی (۲۰۰۱) اشاره کرد.

نظریه PCR

Mullis از زمان کودکی به شیمی علاقه زیادی داشت و به همراه دوستانش هر روز مشغول آزمایشات مختلفی می شد که گاها انفجارهایی را هم در پی داشت. پس از آشنایی با سمیناری بر روی سنتز DNA و کلون کردن ژن، متوجه شد که از شیمی برای تولید DNA می توان استفاده کرد و شور و هیجان او در این باره منجر به استخدام او در مرکز سنتز الیگونوکلئوتید Cetus شد.

مسیر جدیدی توسط آزمایشگاه Erlich که به دنبال یافتن روش های جدیدی برای شناسایی جهش های تک نوکلئوتیدی در مواد ژنتیکی بود در پیش روی او قرار گرفت. آزمایشگاه Elrich تکنیکی را به نام محدود کننده الیگومری (oligomer restriction) ابداع کرده بود که مبنایی برای ایده PCR شد.  یک پروب الیگونوکلئوتیدی نشاندار شده به توالی هدف مکمل خود جفت شده و سپس این دایمر به وسیله یک آنزیم محدود کننده بریده می شد. در حالی که اگر این پروب به درستی توالی هدف را شناسایی نکرده و با آن جفت نمی شد آنزیم نمی توانست آن را شناسایی کرده و ببرد. مشکلات بسیاری بر سر راه این روش وجود داشت و در سال ۱۹۸۳ هنگام تفکر برای حل این معضلات Muliis به نظریه PCR دست یافت.

محدود کننده الیگومری

محدود کننده الیگومری تنها می توانست برای پلی مورفیسم های DNA شناخته شده ای به کار رود که توالی هدف آنزیم را تغییر می‌دادند و برای جهش های ناشناخته قابل استفاده نبود. علاوه براین، چندین کپی لازم بود تا پس از بریده شدن قابل شناسایی باشند.  در نتیجه برای استفاده از محدود کننده الیگومری بر روی توالی هایی به غیر از پلازمید ها، توالی هدف باید تکثیر می شد تا مکان‌های اتصال بیشتری را در دسترس قرار دهد. همچنین توالی هدف باید منحصر به فرد می بود در غیر این صورت پروب به صدها قطعه ناخواسته در طول DNA متصل می شد.

Mullis ناگهان به این فکر افتاد که به جای یک چرخه تکثیر، چندین چرخه تکثیر در حضور مقادیر زیادی از هر چهار نوکلئوتید و پرایمرها می تواند اتفاق بیافتد و سپس از یک الیگونوکلئوتید ثانویه برای اتصال به توالی هدف استفاده کند.  این کار نیاز به آنزیم های محدود کننده را از میان بر می داشت و در نتیجه هر توالی می توانست در صورت وجود یک پرایمر اختصاصی در این روش به کار رود. به دلیل اینکه در هر چرخه موفق تکثیر، تعداد توالی هدف محصول به میزان زیادی افزایش می یابد، محلول اولیه با توالی تخلیص شده مورد نیاز نخواهد بود. از آنجایی که توالی هدف با طول مشخصی قابل تولید بود، قطعات محدود شده می توانستند بر روی یک ژل شناسایی شوند و در نتیجه اتصال غیر اختصاصی در نتایج تاثیری نمی گذاشت.

PCR های اولیه

هنگامی که Mullis برای اولین بار PCR را امتحان می کرد امیدوار بود که به جای نیاز به چرخه های دمایی، مواد خودشان تمام کارها را انجام دهند. چند آزمایش بدون داشتن محصول مورد نظر مشکل ترین بخش را مشخص کرد: دما برای ایجاد چرخه هایی از DNA تک رشته ای به دو رشته ای باید تنظیم می شد و از آنجا که آنزیم پلیمرازی که آن زمان مورد استفاده بود نسبت به دما حساس بود، در هر دور از ۳۰ چزخه، آنزیم تازه باید به محیط اضافه می شد تا محصول به دست آید.

دماها باید به صورت طاقت فرسایی با دست کنترل می شد. این کنترل بدان معنی بود که دمای واکنش را تا ۹۵ درجه سانتیگراد گرم می کردند و سپس به آن اجازه می دادند تا خنک شود و آنزیم DNA پلیمراز را به آن اضافه می کردند و دما را مجددا بالا می بردند، این کار ۳۰ مرتبه تکرار می شد. در نتیجه انجام این کار بسیار وقت گیر و خسته کننده بود. تصور کنید اگر برای تعیین دمای اتصال یک پرایمر، بهینه سازی لازم می‌شد!! بجای اینکه plate خود را در یک دستگاه PCR cycler قرار داده و دماهای اتصال متفاوتی را برای هر ستون انتخاب کنند، هر فرد باید هر نمونه را به کمک دست و با انتقال از یک حمام آب گرم به حمام دیگر در هر ۳۰-۶۰ ثانیه جابجا می کرد. در آن زمان، نمونه ها بر روی plate های ۹۶ خانه امروزی PCR قرار نمی گرفت و در عوض تیوپ‌های جداگانه ای به کار می رفت. در نتیجه زمان مورد نیاز برای جابجایی آنها از یک حمام آب گرم به دیگری به کمک یک تایمر و زمان مورد نیاز برای این کار غیر قابل تصور می‌شد.

اختراع چرخاننده دمایی (thermocycler)

در ۱۹۸۵ و ۱۹۸۷ آنزیم Taq پلیمراز مقاوم به دما و اولین ماشین PCR به نام PCR 1000 Thermal Cycler با همکاری Cetus و Perkin-Elmer وارد بازار شدند. این نوآوری ها منجر به پایین آمدن هزینه و کاهش زمان به کار رفته برای این تکنیک شدند و کاربردهای متعدد جدیدی برای استفاده های تجاری و تحقیقاتی در اختیار دانشمندان گذاشتند.

افراد زیادی را مانند پدر علم ژنتیک Gregor Mendel یا حتی پیش از آن، می توان به عنوان افراد تاثیرگذار در اختراع PCR نام برد. اگر اکنون می توانیم در زمان انجام PCR استراحت کرده و حتی یک قهوه بنوشیم، باید بدانیم که در گذشته این تکنیک بسیار آهسته و زمان بر بوده است. در حال حاضر در زمان ۲-۳ ساعت می توانیم محصول خالصی از مواد ژنتیکی حاوی میلیاردها کپی از توالی هدف را داشته باشیم.

منبع: بیونت

  • نویسنده : بهزاد دماوند
  • تاریخ انتشار : ۲۴-۰۸-۹۳
  1. sozana گفت:

    از مطالب اموزندتون بسیار ممنونم