لوگوی جشنواره وب و موبایل ایران بیونت

ساختمان پلازمیدهای ترکیبی

http://bionet.ir، بیونت، bionet، پلازمید

پلازمید‌ها یکی از پرکاربرد ترین ابزار مهندسی ژنتیک هستند و علی رغم پیشرفت‌های اخیر در زمینه ویرایش ژنوم، همچنان پابرجا باقی مانده اند. در حال حاضر هیچ جایگزین مناسبی برای بیان پروتئین به صورت موقتی یا بیان بیش از حد مقادیر زیاد پروتئین برای تخلیص وجود ندارد. این در حالی است که ساختن یک پلازمید می‌تواند بسیار زمان بر و خسته کننده باشد. در بعضی مواقع الیگونوکلئوتید‌های جدید باید با نقاط برش آنزیمی ‌خاص یا توالی‌های همولوگ، برای هر پلازمید طراحی شوند و مناطق برش آنزیمی‌ در این قطعات باید پیش از کلون سازی دوباره جهش داده شوند.

یک گروه در دانشگاه Edinburgh روش جدیدی برای ساختن پلازمید ارائه داده اند که در آن از مجموعه‌هایی از الیگونوکلئوتید‌های دو رشته ای استفاده می‌شود. در ابتدا آنها الیگونوکلئوتید‌های forward و reverse را برای هر انتهای دو توالی که قرار است به هم بچسبند طراحی کردند. توالی بالادست forward یا UF برای اولین قطعه دارای یک ناحیه اضافی GCC در انتهای ۵’ خود است و توالی پایین دست reverse یا DR برای قطعه دوم دارای ناحیه مکمل GGC در انتهای ۵’ خود است.

در ادامه مطلب با بیونت همراه باشید

این گروه الیگونوکلئوتید‌ها را فسفریله کرده و به هم متصل کردند تا یک سنجاق نصفه (half-clip) دو رشته ای از هر یک از قطعه‌ها ایجاد کنند. سپس آنها الیگونوکلئوتید‌ها را از ناحیه GCC به هم  متصل کردند تا یک سنجاق کامل (paperclip) ایجاد شود. در نتیجه این سنجاق شامل یک الیگونوکلئوتید دو رشته ای است که دو توالی را به هم متصل می‌کنند. GCC اضافه شده تولید یک آلانین می‌کند که تاثیر بسیار کمی‌ در پروتئین الحاقی دارد.

این روش می‌تواند به راحتی برای اتصال چندین توالی در یک ساختمان چند قطعه ای بست داده شود. نویسنده اول این مقاله دکتر Maryia Trubitsyna در این مورد می‌گوید:

"در حال حاضر ما در حال کار بر روی ۶ تکه (۶ کیلو بازی) هستیم. تحقیقات ما نشان می‌دهد که حتی ۸ تکه ( ۷.۴ کیلو بازی) نیز در اتصال سنجاقی محدودیتی ندارند."

برای سرهم کردن پلازمید، این گروه از سنجاق‌ها به عنوان الیگونوکلئوتید‌هایی در واکنش PCR جدیدی به نام "کلون کردن با طویل سازی پلیمراز حلقوی یا CPEC" با پنج یا شش توالی الگوی قابل اتصال استفاده کردند. این قطعات شامل یک مبنای پلازمیدی، پروموتر قابل القا، دو نشانگر آنتی بیوتیکی، GFP یا RFP و GFP+RFP بودند.

در حالی که پلازمید‌هایی با دقت بسیار بالا و دارای بیان پروتئین برای هر دو نوع شش و پنج قطعه ای به دست آورده بودند اما کاهش چشمگیری در تعداد کلونی‌های پلازمید‌های شش قطعه ای مشاهده کردند. این در حالی است که بازده کار با انجام یک چرخه دیگر از PCR یا "boost PCR" افزایش پیدا کرد. این محققان همچنین موفق شدند که پلازمید‌های دو و سه بخشی را از عصاره‌های حاصل از تخریب با استفاده از صوت از E.coli ایجاد کنند.

نویسنده دوم این مقاله Chris French می‌افزاید:

" برتری اصلی این روش امکان استفاده آن برای محققینی است که دارای فریزری پر از کلون‌ها هستند و می‌توانند از این روش برای ایجاد پلازمید ترکیبی حاوی قطعات متفاوت استفاده کنند. در نتیجه این محققان می‌توانند به سرعت پلازمید مورد نیاز خود را برای تحقیق تولید کنند."

منبع: Nucleic Acids Research

  • نویسنده : بهزاد دماوند
  • تاریخ انتشار : ۰۶-۱۰-۹۳