قبل از اینکه شما بتوانید نمونه‌های بافتی را به لحاظ بافت‌شناسی بررسی کنید باید آن‌ها را آماده کنید. یعنی آن‌ها را فیکس کنید، سپس اسلایس های نازکی را برای آنالیز کردن ببرید. بهترین روش برش دادن نمونه‌ها به شکل اسلایس های نازک cryosectioning است. اما cryosectioning در مورد ذوب شدن، تا شدن، حلقوی بودن، چین داشتن، پارگی و شکستگی کاربرد چندانی ندارد و باید این موارد را از اسلایس های جداشده حذف کنیم.
در ادامه همراه بیونت باشید
آماده‌سازی بافتی
Cryosectioning می‌تواند بر روی نمونه فیکس شده در فرمالین و نمونه بافتی تازه انجام شود اما در نمونه فیکس شده در فرمالین آنتی‌ژن‌های موجود در بافت بهتر حفظ می‌شوند.
به‌طور خلاصه، فیکس بافت بهترین انتخاب برای آنالیز مورفولوژیکی است، هنگامی‌که از بافت تازه استفاده می‌کنیم از پوشیده شدن آنتی‌ژن‌ها توسط cross-linking ماده فیکساتور اجتناب می‌کنیم. هنگامی‌که بهترین روش فیکس را برای بافت انتخاب می‌کنید، آماده مرحله آماده‌سازی نمونه و منجمد کردن آن برای cryosectioning هستید.
هنگامی‌که نمونه بافتی خود را منجمد می‌کنید، باید از روش انجماد سریع استفاده کنید تا از تشکیل کریستال‌های یخی در نمونه جلوگیری شود. همیشه باید از جهت بلوک بافتی اطمینان حاصل کنید به‌خصوص اگرچند نمونه بافتی را در یک بلوک داشته باشید. برای شمت حیاتی است که بعد از نصب chuck سرما سنج یک نقطه را بر روی بلوک بافتی علامت بزنید تا جهت را به شما نشان دهد. لبه‌های بلوک بافتی شما بر روی chuck گرد یا مربعی پس از نصب غیرقابل تشخیص خواهد بود. اکنون‌که شما تصمیم گرفته‌اید نمونه را چگونه آماده کنید و نمونه بافتی خود را منجمد کرده‌اید، آماده انجام cryosectioning هستید.
Sectioning به‌طور خلاصه
بلوک بافتی آماده خود را به مدت ۳۰ تا ۶۰ دقیقه از آغاز فرایند sectioning در داخل محفظه سرما ساز قرار بدهید تا دمای نمونه بافتی به ۲۰- درجه سانتی‌گراد برسد. شما می‌توانید تمرین sectioning خود را با بافت‌های غیرضروری یا بلوک O.C.T شروع کنید.
یادگرفتن cryosectioning با بافت ضروری تنها منجر به ضرر و زیان می‌شود. پس این کار را با نمونه‌های غیرضروری شروع کنید تا از هزینه‌های اضافی جلوگیری شود. هنگامی‌که sectioning انجام می‌دهید صبور و خونسرد باشید زیرا در غیر این صورت مرتکب اشتباهاتی مثل تنظیم نادرست دما می‌شوید و دمای مقداری بالاتر می‌تواند نمونه بافتی شمارا ذوب کند.
اکنون بیایید sectioning را شروع کنیم. هنگامی‌که cryosectioning انجام می‌دهید با چرخاندن دستگیره به جلو (به سمت عقب دستگاه و دور کردن از خودتان) بافت را پردازش می‌کنید.
تمرین sectioning را با برش بافت به نازکی ۵۰ میکرومتر شروع کنید، سپس بعد از چند باری که این کار را با موفقیت و بدون مشکل انجام دادید به‌تدریج نازک‌تر کنید (۴۰، ۳۰، ۲۵، ۲۰ میکرومتر). تاخوردگی، پارگی و حباب در بافت ممکن است پیش بیاید که به حداقل رساندن این موارد برای به دست آمدن تصویری باکیفیت مناسب و میزان دقیق برای مطالعه بافتی ضروری است. به حداقل رساندن این موارد نیازمند تمرین و پشتکار است.
شما باید از یک‌قلم موی ریز استفاده کنید تا بتوانید با دقت بالایی بافت را به سمت بالا بچرخانید. در این صورت هنگامی‌که آن را روی سطح شیشه قرار بدهید، از بالا به پایین هیچ انحنایی دیده نمی‌شود. سپس انگشت خود را روی لام شیشه‌ای فشار بدهید. (دقیقاً در جهت عکس طناب بافتی) در این حالت هنگامی‌که شما به‌آرامی لام شیشه‌ای را بر روی نمونه بافتی فشار می‌دهید، گرمای انگشتان شما کمک می‌کند تا نمونه بافتی چین نخورد و به لام شیشه‌ای بچسبد.
توجه کنید هنگامی‌که این کار را انجام می‌دهید نباید تمام سطح شیشه را به سطح فلزی زیر آن فشار بدهید، زیرا اگر برای این کار نیروی بیش‌ازحد نیاز بکار ببرید و اجازه ندهید که لام شیشه‌ای به نمونه بچسبد، نمونه در زمان انجماد به بشقاب فلزی زیر خود می‌چسبد.
بهترین روش، آن است که تا حد امکان بلوک بافتی را نزدیک دستگیره ضد چرخش نوار شیشه‌ای قرار بدهید. این به این دلیل است که زمانی که شما شیشه را بلند می‌کنید، بافت شروع به حلقه زدن به سمت بالا می‌کند.
هنگامی‌که بافت را روی لام شیشه‌ای نصب کردید، توجه داشته باشید که دستتان بیش‌ازحد به تیغه برش نزدیک نباشد تا دست خودتان را نبرید و به خودتان آسیب نزنید.
توضیحات شکل ۱
A: میکرومتر را می‌بینیم که روی آن مشخص می‌کنیم به چه ضخامتی از اسلایس بافتی نیاز داریم.
B: محفظه سرما ساز را می‌بینیم که دارای جام و وسایل تنظیمات میکروتومی دما است.
C: این دستگیره است که اهمیتی معادل ضامن اسلحه دارد.
محل قرار دادن دست‌ها (با جزییات)
به نظر این عنوان بی‌معنی می‌آید اما اگر تا حالا هیچ‌وقت کار sectioning انجام نداده‌اید، برایتان اهمیت زیادی دارد. Sectioning کمی شبیه این است که به‌طور هم‌زمان سرتان را نوازش کنید و معده‌تان را مالش دهید که این کار نیازمند تمرین است اما می‌توانید از پس آن بربیایید. فقط ابتدا با سرعت کم شروع کنید و در برابر bumbling اولیه صبور باشید.
*مرحله اول: با دست راست خود، دستگیره را بچرخانید که این کار سبب حرکت بلوک بافتی و برش خوردن آن می‌شود و هم‌زمان با این کار دست چپ خود را به‌آرامی روی شیشه ضد چرخش فشار بدهید.
*مرحله دوم: هنگامی‌که روبان برش داده‌شده بافت شما از تیغ عبور کرد (بین شیشه ضد چرخش و بشقاب فلزی) ، با دست غالب خود قلم‌مو را بردارید درحالی‌که با دست غیر غالب خود، شیشه ضد چرخش را برمی‌دارید.
*مرحله سوم: sectioning را متوقف کنید و به‌سرعت لام را با دست غیر غالبتان بلند کنید و با قلم‌مو نمونه بافتی را روی آن بچرخانید. زمان لازم را برای جهت‌گیری درست به نمونه بدهید تا چین آن بازشده و گرم شود. سپس به‌آرامی لام شیشه‌ای را روی بافت فشار دهید تا بافت به لام گرم شده بچسبد.
توضیحات شکل ۲
A: شکل microtome است که در محفظه سرما ساز وجود دارد و در ساختار آن دوک قابل‌دیدن، chuck نصب بافت، شیشه ضد چرخش و بشقاب فلزی وجود دارد.
B: chuck در این تصویر دیده می‌شود که بافت را نگاه می‌دارد
C: محفظه سرما ساز به‌طور کامل دیده می‌شود
تمیز کردن محفظه سرما ساز
لازم است بعد از هر عمل sectioning، محفظه سرما ساز تمیز شود که بهتر است این کار در اسرع وقت انجام شود. اما هیچ‌گاه محتویات داخل محفظه را با آب تمیز نکنید! اگر این کار را انجام بدهید محتویات محفظه یخ خواهند زد و منجمدمی شوند و حرکت خود را از دست می‌دهند. برای تمیز کردن، این کار را به‌سادگی انجام می‌دهیم به این صورت که با دستمال‌کاغذی خشک یا حوله کاغذی، بافت‌های باقیمانده را پاک‌کرده و سطح فلزی را تمیز کنید. توجه کنید که حتماً فقط از دستمال‌کاغذی برای تمیز کردن سطوح شیشه‌ای و اطراف تیغه برش استفاده کنید. همچنین می‌توانید بر روی تجهیزاتی که امکان شکسته شدن دربرش رادارند، فیبر قرار بدهید.
چک‌لیست برای موفقیت دربرش
قبل از شروع
۱-قبل از دست‌کاری هر چیزی در داخل محفظه، چک کنید که قفل امنیتی روی دستگیره قفل‌شده باشد. اگر این کار را نکنید در معرض برش خوردن دستتان قرار می‌گیرید.
۲-چک کنید که میکرومتر بر روی ضخامت موردنظر شما قرارگرفته باشد.
۳-مکان قلم‌موی ریز و پنس را در داخل محفظه سرما ساز تنظیم کنید که این به این منظور است که سرد نگه‌داشته شوند و دسترسی به آن‌ها ساده‌تر باشد. این مرحله به این دلیل مهم است که هنگامی‌که شما sectioning را انجام دادید برای یافتن آن‌ها همه‌جا را زیرورو نکنید.
در هنگام برش زدن
۱-جهت‌گیری rostral/caudal را حفظ کنید
۲-بلوک را در داخل cryomold پلاستیکی درست کنید.
۳-بلوک را از cryomold پلاستیکی به chuck منتقل کنید.
۴-لام شیشه‌ای را لیبل بزنید و دوباره چک کنید که اسلایدهای شما پوشیده شده باشد تا از چسبندگی مناسب بافتی اطمینان حاصل کنید.
سعی کنید این مراحل را به همراه جهت‌گیری rostral/caudal و شماره نمونه یکی‌یکی روی کاغذ بنویسید. که این کار به شما جهت تصحیح جهت‌گیری‌های بعدی بافت کمک می‌کند. این کار به‌خصوص درزمانی که تعداد زیادی بافت را باهم در ردیف یا ستون قرار می‌دهید، بسیار مهم است چون بسته به برش شما می‌توانند غیرقابل تشخیص شوند. همچنین لبه‌گرد یا مربعی chuck بافتی شبیه هم به نظر می‌رسند پس نقطه یا خط را توسط ماژیک بر روی O.C.T block بکشید که این نقطه مرجع بعداً خیلی کمک‌کننده خواهد بود.
در صورت اشتباه کردن چیکار کنیم؟
اگر با انجام دادن تمام موارد فوق بازهم مشکلی پیش آمد، خونسرد باشید. اشکال در cryosectioning بسیار شایع است. اگر شما کار cryosectioning را به‌طور حرفه‌ای انجام می‌دهید و تا حالا هیچ اشتباهی نکرده‌اید، احتمالاً شما جز یک نفر از هر یک‌میلیون نفر هستید.
مشکلات تا خوردن و حلقه زدن
یکی از مشکلاتی که زیاد پیش می‌آید، تا خوردن و حلقه زدن بافت هنگام برش بافتی است. اولین چاره این مشکل استفاده درست و هنرمندانه از قلم‌مو است و شما می‌توانید از این قلم‌مو برای صاف کردن بافت‌های حلقه‌زده استفاده کنید.
اما اگر شما می‌خواهید در کار برش استاد شوید، نوبت آن است که این مشکل را به شکل ریشه‌ای حل کنید. قبل از هر چیزی دقت کنید که تیغه برش کاملاً تیز و برنده باشد و کند نباشد. چون اکثر مشکلات تا خوردن و حلقه زدن بافت به دلیل تیغ کند است و بهتر است برای هر بار برش زدن تیغ عوض شود. که با این کار در هزینه اتلاف نمونه‌های بافتی هم صرفه‌جویی می‌شود.
مشکلات سیاه و خرد شدن نمونه
اگر بافت سیاه شود یا حتی خرد شود، نیاز است که دمای محفظه سرما ساز را چک کنید. هنگامی‌که بافت در دمای خیلی پایین قرار می‌گیرد، می‌تواند سیاه شود. دمای پیشنهادی محفظه سرما ساز ۲۰- درجه سانتی‌گراد است. البته اگر شما دوک میکروتوم را روی۲۰- درجه سانتی‌گراد قرار دهید، دمای محفظه شما اندکی کمتر خواهد بود مثلاً ۲۲- یا ۲۳- درجه سانتی‌گراد.
راه هوشمندانه دیگر این است که انگشت اشاره خود را در کنار بلوک بافتی به مدت ۱۰ ثانیه قرار دهید ( البته برای بار سوم می‌گویم که باید به قفل امنیتی دستگیره توجه کنید تا دستتان را نبرید) سپس دستگیره را بازکنید و یک برش دیگر بزنید. اگر سیاهی برطرف شد، نیاز است که دمای محفظه سرما ساز۲ درجه بالا برود.
مشکلات گسترده شدن و پاره شدن نمونه
اگر شما در نمونه بافتی خود گسترده شدن و خط پارگی ممتد دیدید، شیشه ضد چرخش و تیغه برش را با دقت چک کنید زیرا گاهی بافت منجمد یا O.C.T به شیشه ضد چرخش یا تیغ می‌چسبد و این‌ها باعث گسترده شدن نمونه می‌شود.
برای رفع این مشکل به‌دقت سطح شیشه ضد چرخش را با دستمال‌کاغذی تمیز کنید و اگر پارگی همچنان باقی ماند بافت خود را به‌صورت افقی از روی تیغه عبور دهید و اگر بازهم مشکل حل نشد، تیغه را عوض کنید.
اگر شما بافت منجمد خود را گرما دادید یا فقط آن را برای cryosectioning آماده کردید، نگران نباشید و فقط یک برنامه مناسب پشتیبان برای اشکالات احتمالی داشته باشید. در این حالت صبر شما کمک می‌کند تا از ذوب شدن بافت جلوگیری کنید
توصیه‌های زیر را به یاد داشته باشید:
۱-همیشه به یاد داشته باشید که قفل امنیتی روی دستگیره در هنگام عیب‌یابی داخل محفظه فعال باشد.
۲-شماره نمونه داخل بلوک را بر روی لام بنویسید زیرا به دلیل تغییر جهت چندباره آن در طی آماده‌سازی بلوک و قرار دادن بلوک رو لام امکان اشتباه وجود دارد.
۳-همیشه به یاد داشته باشید که از لام شیشه‌ای اضافه برای چسباندن بافت به شیشه در حین رنگ‌آمیزی بافتی استفاده کنید.
۴-دوباره تنظیمات میکرومتر را بر روی سرما ساز چک کنید
۵-به یاد داشته باشید که بافت را به سمت بالا بچرخانید تا بدون چین‌خوردگی شود که برای این منظور باید شیشه هم گرم شده باشد.
در پایان، چیزی که مهم است این است که خونسرد باشید تا نمونه بافتی ارزشمند خود را ذوب نکنید.
اگر هر سؤالی در مورد این مقاله داشتید در پرسیدن آن از طریق کامنت تردید نکنید.
در صورت تمایل می‌توانید مقاله کامل این مطلب را به زبان انگلیسی از لینک منبع مشاهده نمایید، اگر مقاله رایگان نبود از بخش دانلود رایگان مقالات، مقاله کامل را به صورت PDF دریافت کنید.
منبع: بیونت