آیا بازی با کاغذ PH را در آزمایشگاه شیمی به یاد می‌آورید؟ محلول‌های بازی یا اسیدی را بر روی این کاغذ می‌ریختیم و تغییر رنگ آن را مشاهده می‌کردیم. اخیراً محققان در New England Biolabs) NEB) از این ویژگی در تشخیص DNA تکثیر یافته استفاده کرده‌اند. آن‌ها یافته‌های خود را در مجله BioTechniques گزارش کرده‌اند.
برای اطلاع از جزئیات این تحقیق با بیونت همراه باشید
در صورتی که دستگاه‌های تخصصی (همانند thermocylers یا fluorescence detectors) در دسترس نباشند اجرای تست‌های تشخیصی که به تکثیر توالی DNA وابسته‌اند بسیار مشکل هستند. در سال‌های اخیر در چنین موقعیت‌هایی تکنیک‌هایی مانندLAMP یا loop amplification mediated isothermal یا strand-displacement amplification) SDA) مورد استفاده قرار می‌گرفت.
اما عدم نیاز به thermocycler به تنهایی کافی نیست زیرا چالش تشخیص DNA تکثیر شده همچنان پا برجاست. Nathan Tanner یکی از نویسندگان این مطالعه می‌گوید:
«تغییرات مرتبط با فلئورسنت با چشم انسان قابل تشخیص نیست. روش جایگزینی بر پایه رسوب دهی منیزیم پیروفسفات یا نشان گذارهای metal-sensitive وجود دارد که باعث تغییر رنگ می‌شوند اما آن‌ها نیز به سختی با چشم تشخیص داده می‌شوند و به زمان زیادی برای انکوباسیون نیاز دارند یا حساسیت آن‌ها کافی نیست.»
برای حل این مشکلات، Tanner و همکارانش محیط شیمیایی که تکثیر DNA در آن صورت می‌گیرد را مورد بررسی قرار دادند و به ویژه بر روی افزایش اسیدیته به دنبال آزاد شدن هیدروژن (به عنوان محصول جانبی DNA پلیمراز طی سنتر DNA) تمرکز کردند. Tanner اظهار کرد ما عملکرد DNA پلیمراز را در PH ها و وضعیت‌های بافری متفاوت مورد بررسی قرار دادیم و تعداد کمی از واکنش‌های LAMP را با میزان بسیار کمی از بافر تریس مورد آزمایش قرار دادیم. این واکنش‌ها به خوبی انجام شدند از این رو ما کاهش PH را در طول این واکنش‌ها بررسی کردیم. این تغییرات به اندازه کافی زیاد بود که بتوان آن‌ها را با pH indicator dye تشخیص داد.
این مشاهدات نویسندگان را به آزمایشات بعدی سوق داد تا عملی بودن و دقت تکنیک خود را بررسی کنند. Tanner اشاره کرد:
«ما تصور می‌کردیم ساختن محلول‌های واکنش و master mixes با بافر کم بسیار مشکل است و در
آن‌ها پایداری پایینی را ملاحظه خواهیم کرد؛ اما ما پایداری PH، تغییر رنگ و فعالیت آنزیم را بیشتر از دوماه در دمای ۲۰- درجه سانتی گراد به همراه چندین freeze/thaws در دمای اتاق، مشاهده کردیم.»
محققان می‌گویند که تغییرات PH می‌تواند در آزمایش‌های کمی real-time مورد استفاده قرار بگیرد و همچنین سطح متوسط تغییر رنگ بر اساس تعداد کپی‌های هدف و زمان انکوباسیون قابل تشخیص است. در حال حاضر مفیدترین و سریع‌ترین راه اجرای این فنّاوری binary, point-of care test می‌باشد. ترکیبات رنگ و پرایمر قابلیت تطبیق دارند بنابراین میزان آستانه‌ای از نمونه نیاز است تا تغییرات رنگ قابل تنظیم باشد. این تست انعطاف‌پذیری بالایی در تست‌های تشخیصی دارد.
در حال حاضر Tanner و همکارانش در حال کار کردن با اعضای NEB از بخش انگل شناسایی هستند تا عملکرد این تست را در تشخیص انگل‌های filarial در میزبان حامل موردبررسی قرار دهند. Tanner همچنین امیدوار است که این روش تشخیصی در تشخیص عفونت‌های انسانی و بررسی حشرات ناقل مورداستفاده قرار بگیرد.
ما امیدواریم با استفاده از این روش بتوان DNA تکثیر یافته را بدون ابزار خاصی مشاهده نمود.
در صورت تمایل می‌توانید مقاله کامل این مطلب را به زبان انگلیسی از لینک منبع مشاهده نمایید، اگر مقاله رایگان نبود از بخش دانلود رایگان مقالات، مقاله کامل را به صورت PDF دریافت کنید.
منبع: Biotechniques