تست qRT-PCR یا quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction، امروزه به‌عنوان تکنیک اصلی تشخیص mRNA و تعیین مقدار آن به‌حساب می‌آید؛ که به‌اندازه کافی برای اندازه گیری میزان RNA از یک سلول توانایی دارد.
در ادامه همراه بیونت باشید
مرحله رونویسی معکوس (RT)، عامل اصلی تنوع در آزمایش qRT-PCR است و رونویسی معکوس بهینه برای یک qRT-PCR موفق، لازم و ضروری است. دلیل این موضوع این است که الگوهای کلی RNA می‌توانند شامل مهارکننده‌هایی مثل بافر نمکی، اسیدهای چرب، الکل، فنول و… باشند؛ که پس‌مانده فرایند استخراج هستند. این موارد می‌توانند کارایی واکنش‌های RT و PCR را کاهش دهند و سبب ایجاد نتایج نادرستی شوند.
انتخاب روش جداسازی درست RNA یا کیت‌های پالایش RNA از میان هزاران روش موجود می‌تواند به بهبود نتایج کمک کند؛ اما بهترین راه برای گرفتن نتایج دقیق از qRT-PCR، انجام دادن واکنش در ۲ مرحله است که تحت عنوان qPCR خوانده می‌شود.
در زیر برخی از مزیت‌های کیت‌های two-step به نسبت کیت‌های one-step در ریل تایم PCR آورده شده‌اند.
۱-کاهش تشکیل پرایمر دایمر
مشکل:
سایبرگرین نمی‌تواند پرایمر دایمر (PD) را در واکنش‌های qRT-PCR از قطعه اصلی ما تشخیص دهد. تشکیل پرایمر دایمر در طی RT-PCR یک مشکل بسیار بزرگ است زیرابه دلیل این واکنش، منابع برای تولید پرایمر دایمر مصرف می‌شوند که درنتیجه، بازده کاهش می‌یابد و باعث تخمین نادرستی از محصولات موردنظر می‌شود.
پرایمرها، می‌توانند ۳′ duplex قدرتمند خود هیبرید شونده را در دماهای پایین مثلاً ۴۲ تا ۵۰ درجه سانتی‌گراد تشکیل دهند که این همان دمایی است که اکثر واکنش‌های RT در آن، انجام می‌شوند. پس شکل‌گیری پرایمر دایمر می‌تواند در واکنش RT اتفاق بیفتد. وجود مقادیر حتی بسیار کم در ریل تایم PCR با کیت one-step مشکل بزرگی است زیرا این مقادیر کم توسط DNA پلیمراز تقویت خواهند شد.
رونویسی معکوس به‌خودی‌خود می‌تواند به تکثیر پرایمر دایمر کمک کند، زیرا رونویسی معکوس توسط پلیمرازهای وابسته به DNA انجام می‌شود که فعالیت آن‌ها بر الگوهای DNA و RNA تأثیر می‌گذارد و هیبریدهای DNA را ایجاد می‌کند.
حل مشکل:
با انجام دادن qRT-PCR با کیت two-step به‌جای کیت one-step، منتقل شدن پرایمر دایمرهای تجمع یافته در واکنش RT به حداقل می‌رسد؛ که این کار توسط رقیق کردن cDNA به‌دست‌آمده از تشکیل اولین رشته، قبل از استفاده از آن به‌عنوان الگویی برای واکنش qPCR است.
درنتیجه احتمال ایجاد ترکیبات ناخواسته از پرایمر دایمر به خاطر تجمع PD در واکنش RT به شکل شگفت‌انگیزی کاهش می‌یابد؛ اما برای اینکه تشکیل پرایمر دایمر به‌طورکلی از بین برود، نیاز است که شرایط انجام qPCR را هم بهینه کرد.
۲-تنوع
مشکل:
تنوع و تفاوت بین ۲ واکنش مختلف RT، می‌تواند تفسیرهای ما را شدیداً دچار پیچیدگی کند.
ژن کنترل داخلی مثل ژن housekeeping همراه با ژن هدف در طی انجام RT-PCR با کیت one-step تکثیر می‌شود که این فرایند را تقویت نسبی می‌گویند چراکه ژن هدف بر اساس سطح نسبی عرضه ژن housekeeping بیان می‌شود.
برای RT-PCR با کیت one-step، واکنش کنترلی ژن housekeeping می‌تواند به‌صورت واکنش‌های جداگانه monoplex و duplex هم انجام شود.
با واکنش‌های monoplex، ژن‌های کنترل و هدف، توسط الگوهای متفاوت cDNA تکثیر می‌شوند و ازآنجایی‌که واکنش‌های متفاوت RT، می‌توانند کارایی متفاوتی داشته باشند درنتیجه، کنترل واکنش جداسازی می‌تواند مقایسه بین سطوح RNA را پیچیده کند.
بهینه‌سازی تعادل پرایمرها، نیازمند تکثیر کردن مساوی ۲ ژن هدف است تا بتوانیم آن‌ها را باهم مقایسه کنیم
حل مشکل:
استفاده از روش two-step و ۲ واکنش monoplex مرحله‌ای، راه‌حل این مشکل هستند. در مرحله اول از این ۲ مرحله، توسط پرایمرهای غیراختصاصی (مثل oligo dT، هگزامرهای تصادفی، اکتامرها، نونامرها و دکامرها) منابع مشترک cDNA تولید می‌شوند. در ادامه تست های qPCR جداگانه با این cDNA تولید شده گذاشته می شود و تغییرات سطح cDNA اندازه گیری می شود.
همچنین مکمل‌های ژن‌ها در هر واکنش جداگانه مشابه هستند و به همین دلیل هیچ ترجیحی بر تکثیر بیشتر یک ژن هدف بر دیگری وجود ندارد.
۳-کنترل های اضافی
مشکل:
همان‌طور که در قسمت دوم اشاره شد، تکثیر ژن Housekeeping اغلب به‌عنوان راهی برای تخمین مقدار ژن هدف است. هنگامی‌که تعداد زیادی هدف توسط RT-PCR با کیت one-step ارزیابی می‌شود ممکن است تعداد زیادی ژن housekeeping نیز برای هر ژن هدف نیاز باشد.
حل مشکل:
توسط پروتکل RT-PCR با کیت two-step، نیاز به انجام واکنش‌های زیاد ژن‌های housekeeping برطرف می‌شود و تنها یک واکنش کنترلی با ژن خانه دار موردنیاز است. شما می‌توانید تنها از cDNA pool تولیدشده پس از RT به‌منظور شناسایی ژن‌های کنترل و ژن‌های هدف متعدد، استفاده کنید. این به ما توانایی کنترل خوبی علیه تنوع نمونه‌ها و همچنین efficiency واکنش RT ما می‌دهد.
۴-انعطاف‌پذیری
RT-PCR با کیت two-step به شما اجازه می‌دهد که توانایی اضافه کردن هراندازه ترانس کریپتاز معکوس را به واکنش داشته باشید؛ که هرچند مقدار ترانس کریپتاز استفاده‌شده برای سنتز اولین رشته cDNA بیشتر باشد، نتایج دقیق‌تری به دست می‌دهد.
در این حالت، مهم است که مقدار محصولات RT که وارد واکنش‌های qPCR می‌شوند، محدود شود. تصفیه پس از واکنش RT یا رقیق‌سازی محصولات RT، به‌منظور پرهیز از موارد مخل فرایند، الزامی است.
اکثر معرف‌های RT-PCR با کیت one-step، از بافرهای بهینه‌سازی شده هستند که می‌توانند با هر دو RT و PCR کار کنند؛ این موضوع، آنزیم‌های PCR و RT را که می‌توانیم استفاده کنیم، محدود می‌کند. با همه این تفاصیل انتخابی بهتر از RT-PCR با کیت two-step وجود ندارد.
۵-Intra-assay variation
اعتقاد عمومی بر آن است که RT-PCR با کیت one-step، تنوع آزمایش‌ها را کاهش می‌دهند زیرا تمامی مراحل آنزیمی در ویال های مشابه و تحت شرایط کنترل‌شده انجام می‌شوند.
بنابراین Intra-assay variation موضوع مهمی است که در RT-PCR با کیت two-step به آن توجه شده است.
Spelman و همکارانش، نشان دادند که RT-PCR با کیت two-step یک فرایند تکرار پذیر است. (Spelman, F et al, Analytical Biochemistry, 303, 95-98 (2002)
منبع: بیونت