بازی اعداد: چرایی و چگونگی شمارش سلول‌ها

اسحاق نیوتون:

«تعداد آزمایشات نه، بلکه سنگینی هر آزمایش است که باید سنجیده شود.»

اگر هر روش کاری را برای فلوسایتومتری مشاهده کرده باشید، دیده‌اید که در بخشی در ابتدای کار نوشته‌شده “۱ میلیون سلول را درون لوله آزمایش قرار دهید”، پرسش اینجاست که برای انجام کار با این دستگاه پیچیده و نمونه‌های خاص چگونه تعداد سلول‌ها را در یک لوله آزمایش تعیین کنیم؟ در ابتدا به ارائه اطلاعاتی می‌پردازیم که اهمیت دانستن تعداد سلول‌ها را در آزمایش نشان می‌دهد و سپس گزینه‌هایی برای شمارش سلول‌ها در اختیار شما قرار می‌دهیم. لطفاً با بیونت همراه باشید

چرا دانستن تعداد سلول‌ها در نمونه آزمایشی شما مهم است؟

۱. اطمینان حاصل کردن از وجود تعداد کافی سلول برای انجام آزمایش

هیچ ‌چیز بیشتر از این آزار دهنده نیست که تمام یک روز را صرف آماده‌سازی، رنگ‌آمیزی و طبقه‌بندی کردن سلول‌ها (sort) کنید، درنهایت متوجه شوید که در نمونه شما تعداد مناسب سلول برای ادامه دادن آزمایش وجود ندارد. یک حساب سرانگشتی می‌تواند برای اطمینان از وجود تعداد کافی سلول در آزمایش شما بسیار کارآمد باشد. این محاسبه عبارت است از:

تعداد نهایی سلول‌های موردنیاز x (بازده طبقه‌بندی/۱) x (فرکانس/۱) = جمعیت اولیه شروع آزمایش

*بسیاری از طبقه‌بندی کننده‌ها بیش از ۵۰% بازده دارند اما ضرری نخواهد داشت که این مقدار را در نظر بگیریم. اگر سلول مورد نظر بسیار آسیب‌پذیر باشد این مقدار را کاهش دهید.

۲. تعداد سلول‌ها می‌تواند رنگ‌آمیزی را تحت تأثیر قرار دهد

در حالی که تعداد دقیق سلول‌ها برای بعضی از آزمایش‌ها (مثلاً رنگ‌آمیزی سطحی) اهمیت زیادی ندارد، رنگ‌آمیزی سلول‌ها با استفاده از پروب های فلورسنت (مانند DNA، Redox و …) به میزان بیشتری به تعداد سلول‌ها برای موفقیت وابسته هستند.

۳. اهمیت برای سنجش میزان تأثیر

تعداد سلول‌ها برای سنجش قدرت اثربخشی که با استفاده از فلوسایتومتری موردبررسی قرار می‌دهید مهم است. اگر تعداد دقیقی وجود نداشته باشد این محاسبات بی‌معنی خواهند بود.

۴. سلول‌ها طی فرآیند رنگ‌آمیزی از دست می‌روند

دانستن تعداد سلول‌ها در شروع آزمایش و پس از انجام آن می‌تواند میزان از دست رفتن سلول‌ها را مشخص کرده و برای بهینه کردن پروتکل‌ها مورد استفاده قرار گیرد. در رنگ‌آمیزی درون سلولی این از دست رفتن می‌تواند تا ۷۰% سلول‌ها را شامل شود درنتیجه اگر برای انجام فلوسایتومتری ۱ میلیون سلول لازم است، بهتر است رنگ‌آمیزی را با ۳ تا ۴ میلیون سلول شروع کنیم.

چه گزینه‌هایی برای شمارش سلول‌ها وجود دارد؟

هموسایتومتر

یک روش آزمایش شده و دقیق استفاده از هموسایتومتر است. این ابزار که به‌وسیله Louis-Charles Malassez ابداع شده است یک اسلاید اختصاصی میکروسکوپی است که مقدار مشخصی از نمونه را در خود جای می‌دهد. چگونگی استفاده از این ابزار در مطلب “شمارش سلول با استفاده از هموسایتومتر: به سادگی آب خوردن” شرح داده شده است. برای یافتن اطلاعات بیشتر در این زمینه می‌توانید به این پست مراجعه کنید.

هموسایتومتر تنها به ابزار اختصاصی کمی نیاز داشته (تنها یک لامل و میکروسکوپ) و هر فردی می‌تواند با آموزش جزئی این کار را انجام دهد. از این ابزار می‌توان برای شمارش گستره وسیعی از سلول‌ها استفاده کرده و برای محققین به‌عنوان یک ابزار بصری کاربرد دارد. درنتیجه این ابزار بهترین روش (gold standard) برای شمارش سلول به شمار می‌رود.

متأسفانه هموسایتومتر محدودیت‌های خود را نیز دارد. اولین مشکل: قوانین شمارش سلول‌ها باید ذکرشده و قبول‌شده باشد و شیوه شمارش برای رسیدن به عدد یکسان توسط هر محقق در هر تحقیق بسیار مهم است. مورد دوم نیاز به تمرین بسیار بالا برای اطمینان حاصل کردن از انجام درست شمارش است (سعی کنید شمارش سلول به‌وسیله هموسایتومتر را توسط همکاران مختلف خود در آزمایشگاه انجام دهید تا از نتایج متفاوت شگفت‌زده شوید!). سومین محدودیت هموسایتومتر تکیه بر تریپان بلو برای شناسایی سلول‌های مرده است و نهایتاً به‌عنوان یک روش دستی پس از انجام چند تست بسیار خسته کننده خواهد بود.

دیگر گزینه‌ها دستگاه‌های شمارش خودکار هستند که می‌توانند به سه گروه اصلی طبقه‌بندی شوند: تکنولوژی‌های بر پایه تصویر، تکنولوژی‌های شمارش کننده خصوصیات ظاهری (قانون Coulter) و روش‌های بر پایه فلوسایتومتری.

تکنولوژی‌های بر پایه تصویر

شرکت‌های متعددی دستگاهی‌هایی را می‌سازند که با استفاده از تصویر به شمارش سلول‌ها می‌پردازند. به‌طور کلی این دستگاه‌ها از یک میکروسکوپ استفاده می‌کنند تا تصویری را از ناحیه دید تهیه کنند. با استفاده از نرم‌افزار اختصاصی دستگاه، این سیستم سلول‌ها را بر پایه قطر آن‌ها تشخیص داده و آن‌ها را می‌شمارد. این دستگاه‌ها همچنین می‌توانند از تریپان بلو نیز استفاده کنند تا سلول‌های مرده را از شمارش حذف کنند.

در صورت بهینه‌سازی این سیستم‌ها برای شمارش‌های بالای سلولی بسیار مناسب می‌باشند. مشکل اصلی این دستگاه‌ها نیاز آن‌ها به لام ها یا کاست‌های اختصاصی است که معمولاً قیمت آن‌ها را بسیار بالا می‌برد. مورد دوم اطمینان حاصل کردن از این نکته است که این سیستم‌ها بتوانند سلول‌های موردنظر را ازنظر اندازه به‌درستی شناسایی کنند. از شرکت‌های تولیدکننده دستگاه‌ها با این تکنولوژی می‌توان به Nexcelom، Bio-Rad و Invitrogen اشاره کرد.

تکنولوژی‌های شمارش کننده خصوصیات ظاهری

قانون Coulter که برای اولین بار در ۱۹۵۳ ثبت شد پایه دستگاه‌های مدرن شمارش کامل سلول‌های خونی (CBC) و اولین جداکننده‌های تولیدشده به‌وسیله Mack Fulwyler است.

به‌صورت یک قاعده هنگامی که یک سلول از روزنه‌ای که دو بخش پر شده به‌وسیله محلول الکترولیت را از هم جدا کرده است، عبور می‌کند تغییری در پایداری الکتریکی آن رخ می‌دهد. این تغییر پایداری متناسب با اندازه سلول است. بعضی از محدودیت‌های این روش عبارت است از غلظت سلول‌ها (اگر بیش‌ازحد زیاد باشد روزنه مسدود خواهد شد). سلول‌های مرده بر پایه اندازه و تغییر در سیگنال ظاهری شناسایی می‌شوند. نکته مهم اطمینان حاصل کردن از این است که محلول الکترولیت صحیح باشد. اگر نمونه در محلول مناسب حل نشده باشد سنجش خصوصیات ظاهری انجام نخواهد شد.

شرکت‌های Beckman-Coulter، Roche و EMD Millipore همگی تکنولوژی شمارش کننده خصوصیات ظاهری را دارند. این نکته حائز اهمیت است که دستگاه شرکت Millipore به نام Scepter یک ابزار کوچک دستی است که ظاهری شبیه یک پیپت دارد و می‌تواند شمارش چندین نمونه را به‌راحتی انجام دهد.

تکنولوژی‌های بر پایه فلوسایتومتری

شمارش سلول‌ها با استفاده از فلوسایتومتری بسته به اینکه دستگاه فلوسایتومتری چگونه جریان را برقرار کند می‌تواند به دو صورت متفاوت انجام شود.

۱. سیستم پمپ/سرنگ

در صورت استفاده از سیستم پمپ/سرنگ (به‌عنوان مثال دستگاه‌های Accuri، Guava یا Macsquant) از آنجایی که حجم عبوری به‌دقت اندازه‌گیری می‌شود یک شمارش دقیق قابل انجام است. در این سیستم‌ها رنگ‌های مخصوص شناسایی زنده‌بودن سلولی و رنگ‌های سطح سلولی می‌توانند سلول‌های مرده را جدا کرده و دسته‌های خاص سلولی را شناسایی کنند.

۲. سیستم‌های با فشار افتراقی

برای دستگاه‌های فلوسایتومتری که از سیستم فشار افتراقی استفاده می‌کنند (مثلاً LSR-II یا Gallios) از آنجایی که حجم عبوری به‌دقت اندازه‌گیری نمی‌شود بیدهای (bead) شمارش کننده متناسب می‌توانند برای تعیین تعداد سلول‌ها به کار روند. این بیدها به‌وسیله شرکت‌هایی مانند BD Bioscience، Life Technologies و Spherotech تهیه می‌شوند. برای استفاده از این بیدها یک نمونه با حجم مشخصی از این بیدها ردیف می‌شود. این بیدها بدون توجه به سلول‌های موردنظر شمارش می‌شوند و بر پایه تعداد بیدهای شمارش شده در نمونه محاسبه انجام‌گرفته و درنتیجه تعداد سلول‌های موجود در نمونه مشخص می‌شود. البته این بیدها هزینه اضافی را نیز به آزمایش می‌افزایند.

شمارش سلول‌ها برای انجام فلوسایتومتری خوب بسیار مهم است. روش‌های متفاوتی برای مشخص کردن تعداد سلول‌ها در نمونه وجود دارد و هرکدام برتری‌ها و ضعف‌های خود را دارند. از روش استاندار استفاده از هموسایتومتر گرفته تا استفاده از تکنولوژی‌های خودکار راه‌های متفاوتی برای شمارش سلول‌ها در نمونه وجود دارد.

روش مورد علاقه شما در شمارش سلول‌ها کدام‌یک از این گزینه‌ها است؟

منبع: bionet