بررسی پروتئین‌ها: گزیده مقالات مهم سال ۲۰۱۴

در این بخش پنج مقاله اصلی که در سال ۲۰۱۴ در زمینه بررسی پروتئین‌ها چاپ شده اند را با هم بررسی می‌کنیم.

بررسی عملکرد پروتئین‌ها شامل روش‌های بسیار متفاوتی است اما به طور معمول با مرحله اصلی و اولیه بیان پروتئین هدف به صورت آزمایشگاهی (in vitro) و با استفاده از عصاره‌های سلولی و یا در بدن موجودات زنده (in vivo) و با استفاده از جانوران دستورزی ژنتیکی شده آغاز می‌شود. مقالاتی که بیشترین توجه را سال گذشته در زمینه بررسی پروتئین‌ها به خود اختصاص داده اند شامل سه مقاله در زمینه روش‌های کارآمد برای بهینه سازی بیان پروتئین و دو مقاله در زمینه تشریح تکنیک‌های سنجش تغییرات پس از ترجمه در پروتئین‌های یوکاریوتی و تصویر برداری از میانکنش‌های پروتئین-پروتئین غشایی در بدن موجود زنده است.

در ادامه همراه بیونت باشید

۱. سیستم‌های فاقد سلول بر مبنای Escherichia coli برای ذخیره سازی با غلظت بالا و به مدت طولانی

سنتز پروتئین بدون سلول (CFPS) با رونویسی/ترجمه در شرایط آزمایشگاهی، وسیله ای بسیار قدرتمند و مناسب برای به دست آوردن سریع مقادیر زیادی از یک پروتئین هدف است که برای کاربرد‌هایی با بازده بالا مناسب تر از بیان پروتئین در بدن موجود زنده است. سیستم‌های CFPS که به صورت عصاره‌های سلولی فراهم می‌شوند معمولا به صورت محلول‌های آبی فریز می‌شوند و در نتیجه نیازمند فضای زیادی در فریزر‌ها هستند. یک روش برای کاستن از فضای مورد نیاز برای نگه داری از سیستم‌های CFPS در فریزر‌ها آبگیری (lyophlize) از آنهاست که این سیستم‌ها را به صورت یک پودر پروتئینی در حجم بسیار کاهش یافته تبدیل می‌کند. در مقاله ای که در ماه اردیبهشت به چاپ رسیده است گروه Bradley Bundy پروتکل کاملی را برای تولید راحت و سریع یک سیستم CFPS آبگیری شده از عصاره‌های سلولی E.coli گزارش دادند. نه تنها یک سیستم CFPS از E.coli آبگیری شده می‌تواند فضای فریزری مورد نیاز را کاهش دهد بلکه این عصاره‌ها در دمای اتاق پایدارتر نیز بوده و انتقال آنها را آسانتر می‌سازد. نتیجه این روش یک سیستم سنتز پروتئین مناسب می‌باشد که تنها به افزودن آب برای آماده شدن نیاز دارد.

۲. تکنیکی برای افزایش بازده پروتئین در یک سیستم ترجمه ای عصاره رتیکولوسیت خرگوشی

در حالی که سیستم‌های ترجمه فاقد سلولی بر پایه E.coli که در بالا شرح داده شد به دلیل هزینه کم و میزان بیانشان بسیار معمول می‌باشند، سیستم‌های فاقد سلولی پستانداران مانند عصاره رتیکولوسیت خرگوشی (RRL) برای بیان پروتئین‌های پستانداران ارجح تر هستند زیرا تغییرات پس از ترجمه مورد نیاز برای عملکرد درست پروتئین‌ها را اعمال می‌کنند. این در حالی است که نقص بزرگ سیستم RRL بازده پایین پروتئینی آن است. یک روش برای افزایش بازده پروتئینی RRL می‌تواند اضافه کردن عواملی باشد که محصول ترجمه را افزایش دهند. دکتر Denis Kainov و همکارانش فکر کردند که عوامل پروتئینی که ویروس‌ها برای افزایش فعالیت ترجمه ای سلول میزبان در طول آلودگی به کار می‌برند می‌توانند برای این کار مفید باشند. همانطور که به صورت کامل در مقاله آنها که در ماه بهمن به چاپ رسیده است تشریح شد، آنها از پروتئین NS1 آنفلوانزا A استفاده کردند که از خاموش شدن ماشین ترجمه میزبان جلوگیری میکند. در ترکیب با محل اتصال mRNA از ریبوزوم درون سلولی بیماری التهاب قلبی- مغزی (encephalomyocarditis) به mRNA هدف، اضافه کردن NS1 نوترکیب به RRL منجر به افزایش ۱۰ برابری تولید پروتئین شد. این تکنیک قاعدتا برای محققانی که از سیستم RRL استفاده می‌کنند بسیار خوشایند خواهد بود.

۳. استراتژی روشن- خاموش پلی آدنیله کردن به عنوان یک مکانیسم مکمل برای خاموش کردن بیان ژن تراریخته سمی ‌در طی تولید وکتور لنتی ویروسی

با تاکید بر مقاله قبلی در زمینه افزایش بیان پروتئین شاید کمی‌ تعجب آور باشد که مقاله بعدی ما روشی را شرح می‌دهد که به صورت موثری بیان پروتئین را خصوصا برای یک پروتئین تراریخته در سلول‌های پستانداری آلوده شده مهار می‌کند. اما این کار می‌تواند طی تولید وکتور‌های لنتی ویروسی بیان کننده ژن تراریخته سمی،‌ در ژن درمانی بسیار مهم باشد. هنگامی‌ که ژن تراریخته در حال بیان در سلول‌های هدف دارای اثر درمانی است، بیان آن طی تولید وکتور‌های لنتی ویروسی در سلول‌های ۲۹۳T تا جایی که امکان دارد باید خاموش شود زیرا حتی بیان جزئی نیز می‌تواند بازده وکتور را کاهش دهد. معمول ترین روش برای مهار، استفاده از یک پروموتر اختصاصی بافت است که تنها در سلول‌های هدف فعال بوده و در سلول‌های تولید کننده وکتور خاموش است. اما این روش همیشه کارآمد نیست زیرا در سلول‌های ۲۹۳T رونویسی به طور کامل خاموش نمی‌شود. از طریق جابجایی و جهت گیری عوامل کنترل ویروسی و یک ژن تراریخته فاقد سیگنال پلی آدنیلاسیون، تراریخته به شدت در سلول‌های تولید کننده وکتور خاموش می‌شود. این در حالی است که پس از جابجایی عوامل کنترلی ویروسی حاصل از رونویسی معکوس در سلول‌های تراریخته، ژن تراریخته برای بیان شدن نیاز به یک سیگنال پلی آدنیلاسیون دارد. تایید شده است که این تکنیک، روشی تکمیلی برای دیگر استراتژی‌های مهار بیان ژن تراریخته سمی‌ در سلول‌های تولید کننده وکتور لنتی ویروس است.

۴. محلول کردن مجدد پروتئین‌های استیله شده و فسفریله شده با "الکتروفورز ژل پلی اکریل آمید-تریتون اوره خنثی" NUT-PAGE

یک عامل مهم در بررسی پروتئین‌های یوکاریوتی نیاز به  فهم نقش تغییرات پس از ترجمه مانند فسفریلاسیون و استیلاسیون در تنظیم عملکرد پروتئین است. این تغییرات پروتئینی، بار پروتئین را تغییر می‌دهند که می‌تواند به وسیله روش‌های الکتروفورز ژلی بر پایه بار مانند تمرکز ایزوالکتریک (isoelectric focusing یا IEF) جدا شوند. این در حالی است که در بسیاری از موارد IEF باید با SDS-PAGE همراه شود تا پروتئین‌های دارای بار مشابه و جرم متفاوت را از هم جدا کند که معمولا کار بسیاری می‌برد و هزینه بر نیز خواهد بود. یک جایگزین برای IEF ژل‌های بر پایه اوره مانند "اوره اسید استیک تریتون" (TAU) است که پروتئین‌ها را دناتوره می‌کند در حالی که بار آنها ثابت باقی مانده و جداسازی آنها به وسیله جرم و بار امکان پذیر می‌شود. اگرچه در بعضی موارد اسیدی بودن TAU-PAGE می‌تواند منجر به کمتر مشخص شدن بعضی از فسفریلاسیون‌های خاص می‌شود. در مقاله ای که در ماه شهریور به چاپ رسیده است Buehl و همکارانش نشان دادند که این مشکل می‌تواند با استفاده از یک سیستم ژلی بر پایه اوره با pH خنثی بر طرف شود. روش NUT-PAGE این گروه به راحتی گونه‌های فسفریله شده و استیله شده پروتئین‌های اسیدی و بازی را از هم جدا کرده و می‌تواند یک روش ساده، کارآمد و ارزان جایگزین برای IEF و ۲-D PAGE باشد.

۵. بررسی میانکنش‌های پروتئین-پروتئین غشایی با استفاده از FRET-PLA همزمان

فهم عملکرد زیستی بسیاری از پروتئین‌ها شامل بررسی میانکنش آنها با دیگر پروتئین‌ها بوده و برای پروتئین‌های غشایی این کار می‌تواند در ابتدا به وسیله سنجش‌های آزمایشگاهی مانند سیستم جداسازی یوبی کوییتینی (split ubiquitin) شناسایی شود. اما میانکنش‌های پروتئین-پروتیئن (PPI) که به وسیله این سنجش‌ها شناسایی می‌شوند به راحتی با استفاده از روش‌های آزمایشگاهی رسوب دهی ایمنی شناسی همزمان (co-immunoprecipitation) قابل تایید نیستند، زیرا پروتئین‌های غشایی در صورت خارج شدن از غشاء به ندرت به درستی میانکنش می‌دهند. PPI‌های غشایی هنگامی ‌که درون بدن موجود زنده و در غشاء حضور داشته باشند بهتر قابل مطالعه هستند که این عمل به وسیله سنجش‌های انتقال انرژی رزونانس Foster (FRET) یا اتصال نزدیک (PLA) قابل شناسایی است. در مقاله ای که در ماه آبان منتشر شده است Ivanusic و همکارانش نشان دادند که ترکیب این دو روش با یکدیگر و ایجاد تکنیک مکمل FRET-PLA می‌تواند حساسیت و قدرت تفکیک را برای مکان یابی PPI غشایی افزایش دهد. همانند FRET استاندارد یک واکنشگر با پروتئین فلوروسنت زرد (YFP) الحاق می‌شود در حالی که واکنشگر دیگر به پروتئین فلوروسنت فیروزه ای (CFP) الحاق خواهد شد به علاوه هر پروتئین به وسیله یک پپتید دیگر که به عنوان هدف برای اتصال آنتی بادی در PLA به کار می‌رود نیز نشاندار شده است. ترکیب این روش‌ها می‌تواند نزدیکی دو پروتئین غشایی میانکنش داده را در مقیاس نانومتر تشخیص دهد.

منبع: BioTechniques