رسیدن به بازده بالا با بهینه سازی محیط کشت باکتریایی

کشت‌های باکتریایی نسبت به سلول‌های پستانداران بسیار راحت تر رشد می‌کنند اما اگر بازده کار شما کاملا بهینه نباشد پارامترهای زیادی وجود دارد که بتوان با آنها بازی کرد. در این بخش ما چند نکته که برای بهتر کردن محیط کشت خود به آن نیاز دارید را ذکر می‌کنیم. با بیونت همراه شوید

سرعت تکان دادن (shaking)

تکان دادن برای هوادهی محیط کشت لازم است و در نتیجه برای رسیدن به بازده بالا مهم می‌باشد. اما سرعت بهینه برای تکان دادن چقدر باید باشد؟ این چیزی است که شما خود باید با بازی کردن و تغییر آن در هر آزمایش به دست آورید. به طور کلی دورهای چرخش (RPM) بالاتر میزان اکسیژن را بیشتر خواهد کرد اما مواظب باشید که سرعت را بیش از حد بالا نبرید زیرا این کار می‌تواند به سلول‌ها هم از لحاظ فیزیکی و هم با ایجاد تنش اکسید کننده (oxidative stress) آسیب برساند. به طور معمول برای محیط کشت سرعتی برابر ۲۰۰-۲۵۰RPM  استفاده می‌شود.

تمام Shaker‌ها یکسان نیستند

اگر به سرعت بهینه تکان دادن دست یافته اید توجه داشته باشید که اگر آزمایش خود را به Shaker جدیدی منتقل کردید (به عنوان مثال اگر به آزمایشگاه جدیدی منتقل شدید و یا دستگاه خود را تعویض کردید) باید تفاوت قطر محوری یک shaker را جبران کنید تا به میزان مناسب انتقال اکسیژن دست بیابید. خوشبختانه برای رسیدن به این مقدار یک تعادل بسیار ساده وجود دارد.

در این معادله:  r₁ برابر RPM دستگاه قدیمی، r₂ برابر RPM دستگاه جدید، d₁ برابر قطر محوری دستگاه قدیمی ‌و d₂ قطر محوری دستگاه جدید است.

استفاده از فلاسک موج گیردار (baffled flask)

این فلاسک‌ها نباید گیج کننده به نظر برسند! در واقع این فلاسک‌ها همانند فلاسک‌های معمولی می‌باشند اما برآمدگی‌هایی دارند که مانند موج شکن هستند تا در جریان چرخشی مایع در محیط کشت تداخل ایجاد کنند. این کار چه کمکی می‌کند؟ با ایجاد این هرج و مرج میزان اکسیژن جذب شده توسط محیط را افزایش می‌دهید که افزایش اکسیژن به معنی افزایش رشد است.

فلاسک موج شکن دار ندارید؟ میزان تحرک را افزایش دهید

نداشتن فلاسک موج شکن دار پایان دنیا نیست. تنها باید سرعت حرکت را مقداری بیشتر افزایش دهید تا از هوادهی مناسب اطمینان حاصل کنید.

به سرعت در محیط کشت را بپوشانید

ما در آزمایشگاه تنها از فویل آلومینیومی‌ برای پوشاندن در ظرف محیط کشت استفاده می‌کنیم اما دیده‌ایم که در دیگر آزمایشگاه‌ها از گاز برای این کار استفاده می‌شود. در واقع چگونگی پوشاندن در ظروف تاثیر به سزایی در میزان اکسیژن رسیده به محیط کشت دارد. در واقع قرار ندادن درپوش بیشترین مقدار هوادهی را خواهد داشت اما این کار امکان پذیر نیست زیرا باعث به وجود آمدن آلودگی بین نمونه‌ها خواهد شد. در عوض سعی کنید از بستن محکم درها با پنبه جلوگیری کنید، یا از یک غشاء نفوذ پذیر استفاده کنید که در مقابل آلودگی محافظ بوده اما از عبور اکسیژن و دی اکسید کربن جلوگیری نمی‌کند.

حجم را کاهش دهید

یک نکته که در اولین بار برای من سوال به وجود آورد این بود که چرا افراد از یک فلاسک بزرگ استفاده می‌کنند در حالی که محیط کشت کمی ‌را در آن قرار می‌دهند؟ علارقم تصور اولیه من که این افراد بسیار اصراف کننده هستند و یا تجهیزات کافی ندارند واقعیت این است که حجم فلاسک باید حداقل پنج برابر حجم محیط کشت مورد استفاده باشد. دو دلیل اصلی برای این کار وجود دارد:

1. جای تعجب ندارد که دلیل اولی باید اکسیژن باشد. حجم بالا باعث میشود اکسیژن کمتری به محیط کشت برسد.
2. دلیل دوم جلوگیری از ترشح محیط کشت به اطراف و ممانعت از آلودگی است.

مقداری منیزیم اضافه کنید

منیزیم برای رشد بسیاری از باکتری‌ها ضروری است و در نتیجه اضافه کردن آن به صورت MgCl₂ و یا MgSO₄ می‌تواند رشد باکتری‌ها را افزایش دهد مخصوصا هنگامی ‌که از یک محیط کشت پایه مانند LB broth استفاده می‌کنید. بعضی محیط‌ها مانند SOB و SOC به خودی خود دارای منیزیم هستند و در نتیجه نیازی به اضافه کردن منیزیم ندارند.

شما برای بهینه سازی محیط کشت باکتریایی چه نکاتی را پیشنهاد می‌کنید؟

منابع برای مطالعه بیشتر:

 Munna MS, Tamanna S, Afrin MR, Sharif GA, Mazumder C, Kana KS, et al.  (2014) Influence of Aeration Speed on Bacterial Colony Forming Unit (CFU) Formation Capacity. Am J Microbiol Res. 2:47–51.

 Bates MK, Phillips D, O’Bryan J. Predicting Optimal Bacterial Growth. Laboratory Equipment.

 Webb M.  (1949) The Influence of Magnesium on Cell Division The Effect of Magnesium on the Growth of Bacteria in Simple Chemically Defined Media. J Gen Microbiol. 3:418–24.

 Klöckner W, Büchs J. (2012) Advances in shaking technologies. Trends Biotechnol. 30:307–14. 

منبع: بیونت