شمارش سلول با استفاده از هموسایتومتر: به سادگی آب خوردن

در بسیاری از روش‌های زیستی مانند میکروبیولوژی، کشت سلولی، کار با خون و بسیاری از تکنیک‌های دیگر که از سلول‌ها استفاده می‌کنند نیاز داریم که غلظت سلول‌ها را در آزمایش بدانیم. شمارش سلول‌ها به صورت کلی نیازمند روش عمومی‌ استفاده از اتاقک‌های شمارش کننده به نام هموسایتومتر می‌باشد. این ابزار به وسیله یک آناتومیست فرانسوی در قرن ۱۹، به نام Louis-Charles Malassez برای شمارش سلول‌های خون ابداع شد. یک هموسایتومتر از یک لام میکروسکوپی نازک شیشه‌ای دارای شبکه‌ای از مربع‌های‌ هاشور خورده در وسط تشکیل شده است. این شبکه قطر مشخصی دارد و ناحیه پوشیده شده به وسیله خطوط مشخص شده است، در نتیجه شمارش تعداد سلول‌ها در حجم مشخصی از محلول امکان پذیر می‌شود.

در ادامه این مطلب همراه بیونت باشید

معمول ترین نوع هموسایتومتر یک ساختار H مانند دارد که در وسط لام‌ هاشور خورده است و شامل دو سطح مشبک شیشه مانند مجزا و ناحیه ای است که لامل بر روی آن قرار می‌گیرد.

تصویر ۱

قرار دادن نمونه بر روی هموسایتومتر

پیش از شروع کار اطمینان حاصل کنید که هر دوی هموساتومتر و لاملی که روی آن قرار می‌گیرند با استفاده از یک کاغذ تمیز کننده لنز کاملا عاری از هر نوع غبار و ذره ای باشند. لامل استفاده شده بر روی هموساتومتر ضخیم تر از لامل‌های معمول به کار رفته در سنجش‌های میکروسکوپی است، تا بتوانند بر کشش سطحی یک قطره مایع غلبه کنند.

مطمئن شوید که پیش از قرار دادن محلول سلولی، لامل را بر روی سطح شمارش کننده قرار دهید. سپس نوک سمپلر حاوی نمونه خود را همانطور که در تصویر ۲ نشان داده شده در یکی از چاهک‌های V شکل قرار داده و نمونه را تخلیه کنید. ناحیه زیر لامل با استفاده از نیروی مویینه پر خواهد شد. به میزان کافی نمونه باید در محل مورد نظر قرار گیرد تا سطح شیشه ای کاملا پوشیده شود، که این مقدار معمولا ۱۰ میکرولیتر است. دقت کنید بیش از مقدرا لازم نمونه بر روی لام قرار ندهید. می‌توانید دو نمونه را بر روی یک هموسایتومتر قرار دهید به صورتی که هر نمونه بر روی یک ناحیه مشبک قرار گیرد.

تصویر ۲

سپس هموسایتومتر دارای نمونه بر روی صفحه میکروسکوپ قرار گرفته و بر روی بخش مشبک با قدرت کم تمرکز می‌شود. اجازه دهید نمونه برای چند دقیقه ثابت بماند و از برداشتن لامل خود داری کنید زیرا این کار باعث خواهد شد حباب‌های هوا در زیر آن تشکیل شده و شمارش دشوار شود.

شمارش سلول‌ها در هموسایتومتر

یک شبکه کامل در هموسایتومتر شامل ۹ مربع است که هر کدام ۱ میلی متر مربع می‌باشند (تصویر ۳). ناحیه شمارش مرکزی هموسایتومتر (تصویر ۳B) شامل ۲۵ مربع بزرگ است و هر مربع بزرگ دارای ۱۶ مربع کوچکتر است. هنگامی‌ که شمارش را انجام می‌دهید تنها سلول‌هایی را که بر روی خطوط دو لامل قرار گرفته بر روی مربع‌های بزرگ هستند شمارش کنید تا از شمارش دوباره سلول‌ها اجتناب کنید ( تصویر ۳G). محلول‌ها باید به میزانی رقیق شوند که هر سلول یا هر ذره ای که شمارش می‌شود بر روی هم قرار نگیرند و به صورت یکسانی پخش شده باشند.

تصویر ۳

برای تفاوت گذاشتن بین سلول‌های مرده و زنده، نمونه معمولا در یک رنگ خاص مانند تریپان بلو محلول می‌شود. این روش رنگ آمیزی به نام رنگ آمیزی حذف با رنگ (dye exclusion staining) شناخته شده که با استفاده از یک رنگ دوظرفیتی که از غشاء سلول‌های مرده می‌گذرد و آنها را آبی می‌کند شناخته می‌شود، در حالی که سلول‌های زنده این رنگ را جذب نمی‌کنند و در نتیجه سلول‌های زنده از مرده تفکیک می‌شوند. هنگامی ‌که این نمونه در زیر میکروسکوپ مشاهده شود سلول‌های مرده مانند نقطه‌های تاریک دیده می‌شوند (تصویر ۴).

تصویر ۴

برای انجام شمارش، بزرگ نمایی مورد نظر برای تشخیص سلول‌ها را در مربع‌ها انتخاب کنید به صورتی که شمارش نهایی چیزی حدود ۱۰۰ سلول شود. این مقدار برای شمارشی که از نظر آماری درست باشد مناسب است. برای سلول‌های بزرگ به راحتی می‌توانید تنها سلول‌های موجود در چهار مربع بزرگ کناری (تصویر ۳C-F) و میانی (تصویر ۳B) را شمارش کنید. برای یک مجموعه سلولی ریز و متراکم می‌توانید سلول‌هایی را که در چهار مربع خارجی و داخلی مربع وسطی قرار می‌گیرند (تصویر ۳B) شمارش کنید و یا اینکه یک محلول رقیق تر آماده سازید.

به یاد داشته باشید که سلول‌هایی که خط بالایی و یا راستی یک مربع را قطع می‌کنند در شمارش خود وارد کنید اما سلول‌هایی که خط پایینی را قطع می‌کنند نشمارید (تصویر ۳G). ناحیه میانی (تصویر ۳B) و هر یک از مربع‌های کناری (تصویر ۳C-F) یک میلی متر در ۱ میلی متر می‌باشند که برابر با ۱ میلی متر مربع است و عمق هر مربع ۰.۱ میلی متر است. حجم نهایی هر مربع در این عمق می‌شود ۱۰۰ نانولیتر. هنگامی ‌که شمارش تمامی ‌سلول‌ها را انجام دادید غلظت سلولی می‌تواند به وسیله فرمول زیر محاسبه شود:

dilution factor = میزان رقیق شدگی                     of squares # = تعداد مربع ها

به عنوان مثال اگر شما نمونه خود را به نسبت ۱:۱ با تریپان بلو رقیق کرده باشید و ۳۲۵ سلول را در ۴ مربع کناری و مربع بزرگ وسطی شمارش کرده باشید تعداد کل سلول‌ها در هر میلی لیتر برابر است با:

اگر می‌خواهید میزان کل سلول‌ها را در نمونه خود محاسبه کنید تنها تعداد سلول‌های به دست آمده را در حجم نمونه خود ضرب کنید. به عنوان مثال اگر حجم نمونه اصلی شما ۵ میلی لیتر باشد تعداد نهایی سلول‌های شما برابر خواهد بود با:

منبع: BioNet