هم بیانی ژنی در سازه‌های دو سیسترونی

تصور کنید در حال کار کردن با یک ژن هستید و آن ژن پتانسیل بسیار شگفت‌انگیزی دارد. حالا شما ژن را به درون سلول وارد می‌کنید و تمام! اما حالا چه اتفاقی می‌افتد؟

ژن‌ها ابزارهای قدرتمندی برای کنترل و هدایت فعالیت سلول‌ها هستند، اما به دلیل کنجکاوی و شخصیت ماجراجوی محققان، ما می‌خواهیم بیشتر در مورد آن‌ها بدانیم:

• می‌خواهیم پیوستگی ژن‌هایمان را تأیید کنیم و شاهد اثر آن‌ها در انجام یک عمل باشیم.
• می‌خواهیم قادر به انتخاب کلونی از ژن‌های موردنظر خودمان باشیم.
• می‌خواهیم اثر هماهنگ دو ژن که به‌صورت مشترک باهم کار می‌کنند را مطالعه کنیم.

قبلاً یک ژن داشتیم و روی آن مطالعه‌های زیادی کردیم. حالا نوبت دومی است!

برای پاسخ به همه این خواسته باید چه کرد؟ با بیونت همراه باشید

معرفی پلاسمید دوسیسترونی (bicistronic plasmid)

همان‌طور که از اسمش مشخص است، پلاسمیدهای دوسیسترونی از دو ژن مجزا موردنظر ما تشکیل شده‌اند که روی یک وکتور قرار دارند. وکتور ژن‌ها را باهم به درون سلول منتقل می‌کند، این بدین معنی است، هر سلول که قبلاً یک ژن داشت، اکنون ژن دوم را نیز می‌تواند داشته باشد. این انتقال Cotransfection نام دارد. از طرف دیگر هیچ تضمینی وجود ندارد که این اتفاق صورت گیرد و ممکن است سلولی را بیابید که تنها یکی از ژن‌ها را دارد. بنابراین، انتقال ژن‌ها باهم، سطح دیگری از میزان اعتماد به Transfection را ایجاد می‌کند.

این پلاسمیدها مزیت مجزای دیگری نیز دارند:‌ آن‌ها قادر به‌جای دادن پهنای وسیعی از ترکیبات مختلف ژنی روی خود هستند. برای اینکه بتوانید روی ژن خاصی که در نظر دارید تحقیق انجام دهید، می‌توانید ژنی انتخابی یا Reporter را اضافه کنید. به‌منظور بسط مطالعه خود به سمت میان کنش پروتئین‌ها، می‌توانید ژن‌های گوناگونی را در یک ترکیب قرار داده و عملکرد ارتباط آن‌ها با یکدیگر را بررسی کنید.

خوب، یک پلاسمید دوسیسترونی می‌خواهید؟ چگونه ژن‌ها را به هم متصل می‌کنید؟!

مشکلی نیست، ما در بیونت سه تکنیک برای هم بیانی ژن‌های مختلف را معرفی می‌کنیم.

دو پروموتر

بهترین روش برای رسیدن به این منظور، استفاده از یک پروموتر ثانویه داخل همان وکتور است. در روش دو پروموتری، وکتور شما دارای دو کاست بیانی مجزاست که برای هر ژن پروموتری جداگانه دارد.

این سیستم زمانی ایده آل است که شما بخواهید بیان هر دو نوع پروتئین این ژن‌ها را در یک سطح یکسان داشته باشید، اگر انتظارتان بر این است که آن‌ها بیانی مساوی داشته باشند. البته، کارایی میزان بیان می‌تواند تحت تأثیر اندازه پروموترها و ژن‌ها قرار گیرد. مشکلات این روش زمانی به چشم می‌آید که فضا در وکتور محدود باشد.

جایگاه ورود ریبوزوم داخلی (IRES)

در این روش، شما درواقع از توانایی ذاتی یک ویروس برای بیان ژن‌های اضافه‌شده از بسط دادن یک mRNA استفاده می‌کنید. IRES عمل رونویسی هر دو ژن را در یک mRNA مرتبط کرده و سپس ترجمه ژن‌ها به‌صورت جداگانه با شروع ترجمه از روی آن mRNA از محل IRES انجام می‌شود.

استفاده از IRES نیاز به پروموتر ثانویه را کم می‌کند و درنتیجه به فضای کمتری نیاز دارد، اما درعین‌حال معایبی نیز دارد. ژن دوم که توسط IRES رونویسی می‌شود معمولاً بیان کمتری خواهد داشت و کارایی IRES با توجه به نوع سلول متفاوت خواهد بود. این نکته نیز قابل‌توجه است که توالی IRES می‌تواند متفاوت باشد و این امر میزان بیان را تحت تأثیر قرار می‌دهد.

اجزای IRES از ویروس Encephalomyocarditis و دیگر picornavirus ها به‌خصوص از ویروس‌های عامل بیماری‌های دهان و پا جداسازی شده‌اند، آن‌ها همچنین می‌توانند طولی متفاوت داشته باشند. برخی از انواع تجاری آن‌ها دارای جهش نیز هستند.

توالی‌های پپتید ۲A (P2A)

این توالی‌ها نیز از ویروس Picorna هستند و قابلیت جالب خود شکافندگی دارند. توالی‌های P2A بین دو ژن موردنظر شما می‌نشینند و باعث پرش (skipping) ریبوزومی طی فرایند ترجمه می‌شوند. این امر باعث از بین رفتن یک باند پپتیدی شده و بنابراین دو پروتئین از هم جدا می‌شوند. مزیت مهم P2A طول آن است که تنها از ۱۹ آمینواسید تشکیل شده و نکته مثبت دیگر این است که بیان هر دو ژن قابل قیاس با بیان نرمال آن‌ها می‌باشد.

دو مانع اصلی در استفاده از این روش وجود دارد. اول اینکه هر دو ژن جزئی از توالی P2A را به دلیل عمل شکافتن به همراه دارند. چندین آمینواسید از آن روی ژن بالادستی و یک پرولین در ابتدای ژن دوم باقی می‌ماند. دوم اینکه، کارایی بیان بستگی با کارایی آن شکست دارد و می‌تواند تحت تأثیر ژن پایین‌دستی قرار گیرد. اگر شکست به‌درستی انجام نگیرد، شما یک پروتئین ترکیبی با عملکرد ضعیف و یا بدون عملکرد خواهید داشت مگر اینکه ژن به‌عنوان یک پلی پروتئین بیان شود.

درنتیجه، انتخاب روش درست برای انجام بیان همزمان دو ژن، بستگی به نیازهای اختصاصی و همین‌طور محدودیت‌های شما دارد. روش دو پروموتری سیستمی قدرتمند و کارآمد است درصورتی‌که فضای کافی درون وکتور داشته باشید.

IRES جایگزینی ایده آل برای زمانی است که محدودیت فضا دارید و میزان بیان برایتان اهمیت چندانی ندارد.

سیستم P2A موقعیت خوبی را برای انتقال ژن‌های بزرگ و یا حتی ژن سوم ایجاد می‌کند اما ممکن است نیاز به شرایطی خاص داشته باشد.

به‌هرحال با انتخاب هرکدام از آن‌ها، پلاسمیدهای دوسیسترونی می‌توانند ابزاری توانمند را برای انجام تحقیقات شما فراهم کنند و باعث ایجاد پتانسیلی حیرت‌انگیز در عرصه پویای بیولوژی مولکولی شوند.

منبع: بیونت