طبق معمول هر شنبه، با یک مطلب آموزشی همراه شما دوستان خواهیم بود.
یکی از کارهای معمول در زیست شناسی مولکولی، تخلیص DNA از محلولی می باشد که حاوی نمک های بافری، آنزیم ها و یا دیگر موادی است که می توانند در مراحل بعدی عملیات آزمایشگاهی مشکل ساز باشند. به عنوان مثال تخلیص واکنش های PCR، محصولات برش های آنزیمی یا دیگر تیمار های آنزیمی و تخلیص DNA ژنومی یا پلازمیدی که با پروتئین/دبری های سلولی آلوده شده است. روش های مختلفی برای تخلیص DNA وجود دارد که در اینجا به پنج مورد اشاره می کنیم.
- استخراج فنول/کلروفورم
استخراج فنول کلروفورم که معمولا پس از آن رسوب با اتانول انجام می شود روشی معمول برای حذف پروتئین از نمونه های DNA است. در این روش محلول DNA با فنول و کلروفورم ترکیب می شود. DNA محلول در آب در فاز آبی می ماند در حالی که پروتئین ها به وسیله محلول های آلی دناتوره می شوند و در فاز آلی قرار می گیرند. فاز مایع که حاوی DNA بدون پروتئین است می تواند جمع آوری شود.
برتری ها: روشی ارزان و موثر برای حذف پروتئین ها از DNA.
مشکلات: نسبت به بیشتر روش های نوین کند بوده و خطر انتقال فنول/کلروفورم به مرحله آخر وجود دارد ( که می تواند واکنش های آنزیمی در مراحل بعدی را مهار کند). فنول و کلروفورم هر دو مواد شیمیایی خطرناکی هستند (هنگام کار موارد ایمنی حتما باید رعایت شود).
- رسوب با اتانول
رسوب با اتانول یک روش آزموده شده و انجام شده برای تغلیظ DNA می باشد. کاتیون های تک ظرفیتی به غلظت ۱/۰ تا ۵/۰ مولار ( معمولا نمک استات سدیم) به همراه اتانول با غلظت نهایی ۷۰% به DNA اضافه می شود. ساختمان DNA به وسیله اتانول تغییر کرده و در نتیجه تجمع یافته و رسوب می کند (Eickbush و Moudrianakis 1978). به دلیل اینکه بیشتر نمک ها و مولکول های آلی کوچک در اتانول ۷۰% محلول هستند، در مایع باقی می مانند و رسوب DNA می تواند به وسیله سانتریفیوژ جدا شود.
برتری ها: ارزان و موثر بودن برای نمک زدایی و تغلیظ DNA
مشکلات: زمانبر بودن و احتمال انتقال اتانول به نمونه نهایی
- کیت هایی بر مبنای ستون های سیلیس
کیت هایی که بر مبنای ستون توسط کمپانی ها عرضه می شوند روش های مناسبی برای تخلیص DNA می باشند. مبنای این روش اضافه کردن نمک های کاوتروفیک (chaotrophic) به نمونه برای دناتوراسیون DNA به کمک حذف پیوند های هیدروژنی است. در این شرایط DNA به طور انتخابی به رزین های سیلیس در ستون ها متصل شده و از باقی مواد جدا می شود. پس از شستشو با استفاده از محلول کم نمک و به علت کاهش یافتن تمایل به سیلیس، DNA از ستون جدا شده و مجددا شکل طبیعی خود را به دست می آورد. مثال خوبی از این تکنیک سری Qiagen Qiaquick است که کیت های متعددی برای استخراج از ژل آگارز، واکنش های آنزیمی، تخلیص نوکلئوتیدی و PCR به بازار عرضه می کند.
برتری ها: راحتی و سرعت، کاربران می توانند حجم زیادی از نمونه را با استفاده از دستگاه مکش انجام دهند
مشکلات: بسیار گران، بازده کم ( در حدود ۲۵%) و باقی ماندن نمک های کاوتروفیک در ستون
نکته: کیت تخلیص و تغلیظ Zymo DNA با استفاده از حجم کم محلول هنگام جدا سازی از ستون، غلظت بالای DNA را فراهم می کند.
- رزین های Startaclean
روش Startanene شرکت StartaClean از سیلیس هیدروکسیله شده مایع استفاده می کند که با تمایل بالایی به پروتئین ها متصل می شود و در شرایط pH خنثی به DNA متصل نخواهد شد. این مایع مستقیما به نمونه DNA اضافه می شود و سپس مخلوط شده و سانتریفیوژ می شود. رسوب حاوی DNA و بدون پروتئین است که قابل استفاده خواهد بود. کل روش بیش از چند دقیقه به طول نمی انجامد در حالی که ممکن است برای بعضی از آنزیم های مقاوم ۲ تا ۳ بار تخلیص لازم باشد.
برتری ها: بسیار سریع و ارزان، نمک های بازدوست یا آلی استفاده نمی شود
مشکلات: تنها پروتئین ها را حذف می کند. حذف نمک ها نیازمند یک مرحله رسوب با اتانول می باشد.
- مهره های (beads) آهنربایی
این روش از مهره های آهنربایی استفاده می کند که تحت شرایط خاصی به DNA متصل شده و با استفاده از میدان آهنربایی می توانند ثابت شوند تا DNA را از باقی مواد جدا کنند. تکنیک CargeSwitch از شرکت Invitrogen یکی از بهترین مثال ها برای این روش می باشد. این تکنیک از مهره های آهنربایی با بار مثبت استفاده می کند، در نتیجه این مهره ها در pH پایین به DNA متصل می شوند اما با افزایش pH بار آنها منفی شده و DNA را آزاد می سازند.
برتری ها: سریع بودن، نداشتن نمک های باز دوست یا محلول های شستشوی آلی، بازده بسیار خوب با خلوص اسپکتروفوتومتری بالا
مشکلات: هزینه اولیه برا تهیه آهنربا ها زیاد می باشد و هنگامی که تعداد نمونه زیاد باشد کار بسیار مشکل خواهد شد
به نظر می رسد توضیحات بالا برای آشنایی ابتدایی مفید باشد. در آینده با توضیحات کامل تر این روش ها با شما همراه خواهیم بود. در صورت هر گونه سوال یا نظری آماده پاسخگویی به شما دوستان عزیزان هستیم.
منبع: بیونت