چگونگی عملکرد لیز قلیایی (alkaline lysis)

لیز شدن قلیایی اولین بار توسط Birnboim و Doly در سال ۱۹۷۹ تشریح شد و تنها با تغییرات جزئی از آن زمان تا به امروز به عنوان روش برتر استخراج DNA پلازمیدی از باکتری ها شناخته می شود. بهترین راه توضیح نحوه عملکرد این روش بررسی مراحل انجام آن به صورت جز به جز می باشد. بیایید باهم نگاهی دقیقتر به مراحل این روش داشته باشیم. با بیونت همراه باشید:

۱. رشد و آماده سازی سلولی

این روش با رشد دادن باکتری هایی که حاوی پلازمید مورد نظر می باشند در محیط کشت آغاز می شود. زمانی که سلول ها به رشد مناسب رسیدند به کمک سانتریفیوژ آنها را رسوب می دهیم تا از محیط کشت جدا شوند.

۲. محلول سازی مجدد

رسوب به دست آمده از مرحله پیش مجددا در محلولی (که معمولا در کیت های مختلف محلول ۱ نامیده می شود) حاوی تریس، EDTA، گلوکز و  RNaseAحل می شود. کاتیون های دو ظرفیتی (Mg2+, Ca2+) برای فعالیت DNase و انسجام دیواره باکتری ضروری هستند، اما EDTA با به دام انداختن (chelates) کاتیون های دو ظرفیتی از آسیب دیدن پلازمید به وسیله DNase جلوگیری کرده و همچنین باعث ناپایداری دیواره سلولی برای انجام مراحل بعدی می شود.

۳. لیز کردن

بافر لیز کردن (که معمولا محلول ۲ نامیده می شود) حاوی هیدروکسید سدیم (NaOH) و شوینده سدیم دودسیل (لوریل) سولفات (SDS) است. عملکرد SDS حل ساختن غشاء سلولی است. NaOH نیز به این کار کمک می کند اما مهمتر از آن با از بین بردن پیوندهای هیدروژنی بین بازهای DNA، باعث تبدیل شدن DNA دو رشته ای (dsDNA) ژنومی (gDNA) و پلازمید به DNA تک رشته ای (ssDNA) در درون سلول می شود. این فرآیند دناتوراسیون (denaturation) نامیده می شود و به همین دلیل آن را لیز کردن قلیایی می نامند. SDS همچنین باعث لیز شدن بیشتر پروتئین های درون سلول می شود که به جداسازی بعدی پلازمید از پروتئین ها کمک شایانی خواهد کرد.

• در این مرحله بسیار مهم است که اطمینان پیدا کنیم بافرهای محلول سازی مجدد و لیز کردن به خوبی باهم مخلوط شوند (اگرچه نباید در این کار شدت زیادی اعمال شود). این نکته را نیز به یاد داشته باشید که SDS و NaOH خورنده می باشند پس هنگام کار دستکش مناسب داشته باشید و در صورت امکان از عینک های محافظ چشم استفاده کنید.

۴. خنثی سازی

اضافه کردن استات پتاسیم (محلول ۳) باعث تغییر خاصیت قلیایی محلول می شود. طی چنین شرایطی پیوندهای هیدروژنی بین بازهای تک رشته ای DNA مجددا ایجاد شده و در نتیجه ssDNA مجددا به dsDNA تبدیل می شود. این بخش انتخابی می باشد. در حالی که DNA حلقوی کوچک پلازمیدی به راحتی به حالت اصلی باز می گردد، gDNA بزرگ نمی تواند به راحتی این فرآیند را طی کند. به همین دلیل مهم است که در مرحله لیز، با ملایمت رفتار بکنیم زیرا هم زدن با شدت زیاد یا ورتکس کردن باعث قطعه قطعه شدن gDNA شده و رشته های کوتاهی را به وجود می آورد که می توانند دو رشته ای شده (re nature) و باعث آلوده ساختن پلازمید به دست آمده شوند.

در حالی که پلازمید دو رشته ای به راحتی می تواند در محلول حل شود، DNA تک رشته ای ژنومی، SDS و پروتئین های سلولی دناتوره شده به دلیل میانکنش های آبگریز به صورت یک رسوب سفید رنگ به یکدیگر متصل می شوند. این رسوب به راحتی می‌تواند به کمک سانتریفیوژ از DNA پلازمیدی جدا شود.

۵. تصفیه کردن و تغلیظ

اکنون DNA پلازمیدی شما از بیشتر دبری های سلولی جدا شده است، اما هنوز در محلولی است که مقادیر بالایی از نمک، EDTA ،RNase و دیگر پروتئین ها و دبری های سلولی را در خود دارد که برای استفاده در مراحل بعدی مناسب نمی باشند. مرحله بعدی تصفیه کردن محلول و تغلیض DNA پلازمیدی است.

روش های مختلفی برای این کار وجود دارد. مانند استخراج فنول/کلرفورم که پلازمید به وسیله اتانول رسوب داده می شود و یا روش های بر پایه کروماتوگرافی که به کمک ماده ای به صورت انتخابی با DNA پلازمیدی طی شرایط خاص نمکی و PH اتصال برقرار می کند و سپس با تغییر شرایط از آن جدا می شود. معمول ترین روش های تخلیص در مطلب پنج روش برای تخلیص DNA قبلا توسط بیونت ارائه شده است.

منبع: بیونت