PCR: گزیده مقالات مهم سال ۲۰۱۴

تکنیک PCR امروزه چنان روش پایه ای در زیست شناسی مولکولی مدرن است که هر نوآوری و پیشرفتی در این زمینه به وسیله محققان، بسیار مورد استقبال قرار می‌گیرد. نویسندگان بیونت نیز از این قاعده مستثنی نیستند و خوشحالند که سال ۲۰۱۴ همراه با تکنیک‌های جدید و قویی همراه بوده است. در این بخش ما پنج مقاله اصلی چاپ شده در زمینه روش PCR در سال گذشته را ذکر می‌کنیم که از پیشرفت‌هایی در اختصاصیت و حساسیت واکنش‌های PCR معمولی گرفته تا دستورالعمل‌های روش بسیار جدید digital PCR را شامل می‌شوند.

در ادامه با بیونت همراه باشید

۱. فعالیت جابجایی رشته DNA پلیمراز مقاوم به حرارت، به میزان قابل توجهی همانند سازی DNA را بهبود می‌بخشد.

چه کسی از یک ابزار چند کاره خوشش نمی‌آید؟ چرا یک چاقو و انبر دست جدا با خود حمل کنیم وقتی می‌توانیم آنها را با هم ادغام کنیم؟ در شماره شهریور مجله BioTechniques، ایگناتوف و همکارانش DNA پلیمراز جدیدی را معرفی کردند که علاوه بر استفاده در واکنش PCR معمولی می‌توانست در تکثیر همدما (isothermal amplification) نیز به کار رود. تا به حال این دو روش تکثیر نیازمند دو نوع کاملا متفاوت از DNA پلیمراز بودند. برای PCR یک DNA پلیمراز مقاوم به دما مانند Taq لازم بود که بتواند دمای ذوب شدن (denaturation) در هر چرخه PCR را تحمل کند و برای تکثیر همدما، DNA پلیمرازی مانند Bst نیاز بود که دارای فعالیت شدید جابجایی رشته باشد تا بتواند رشته‌ها را همانند ذوب با حرارت از هم جدا کند. دکتر Ignatov و همکارانش یک Taq DNA پلیمراز جهش یافته جدید با خاصیت شدید جابجایی رشته به نام SD DNA پلیمراز را گزارش کردند که نه تنها می‌توانست برای PCR،  برای تکثیر همدمای وابسته به حلقه (LAMP) و برای روشی که به تازگی بیان شده است به نام واکنش پلیمرازی جابجایی رشته کاربرد داشته باشد، بلکه حساسیت و اختصاصیت را حتی در شرایط سخت مانند PCR قطعات طویل یا تکثیر الگوهای غنی از GC بهبود می‌بخشید. این DNA پلیمراز همه کاره ثابت کرد که می‌تواند به عنوان یک آنزیم تکثیر DNA در جعبه ابزار مورد نیاز کاربران قرار گیرد.

۲. ترومبین گاوی حساسیت و اختصاصیت واکنش زنجیره ای پلیمرازی را افزایش می‌دهد

این که PCR به درستی کار نکند و یا محصولات تکثیر غیر اختصاصی و پرایمر دایمر به جای محصول مورد نظر داشته باشید می‌تواند بسیار ناراحت کننده باشد. در طول سال‌ها، ترکیبات متعددی به واکنش PCR افزوده شده است تا حساسیت و اختصاصیت تکثیر DNA را افزایش دهند. این افزودنی‌ها شامل گستره ای از مواد هستند، از مولکول‌های کوچک آلی مانند گلیسرول و بتائین گرفته تا شوینده‌های غیر یونی مانند Triton X-100 و Tween و همچنین پروتئین‌هایی مانند BSA. متاسفانه هر کدام از این افزودنی‌ها تنها تحت شرایط خاصی PCR را بهبود می‌بخشند. ماده ای که بسیار مطلوب خواهد بود یک تشدید کننده PCR است که بتواند در هر شرایطی فعالیت داشته باشد، این چیزی است که Xinhui Lou و همکارانش به طور غیر منتظره ای در ترومبین گاوی (BT) کشف کردند. همانطور که در مقاله آذر ماه آنها شرح داده شده است، BT می‌تواند حساسیت و اختصاصیت PCR را با غلظت‌هایی ۲۰ تا ۱۸۰ برابر کمتر از BSA در گستره بسیار زیادی از الگوها افزایش دهد و این در حالی است که دارای خاصیت جلوگیری کننده از مهار ایجاد شده به وسیله ریز ذره‌ها (nanomaterials) مانند اکسید گرافن و ریز ذره‌های طلا نیز است.

۳. تکثیر خطی، هدف پیش از PCR برای بهبود نتایج در صورت وجود مقادیر کم DNA الگو

یک کاربرد مهم PCR تکثیر مقادیر ناچیز DNA منبع برای ایجاد مواد مناسب در تحقیقات جنایی یا باستان شناسی است. این در حالی است که یک مشکل عمده وجود دارد و آن افزایش چرخه‌های PCR است که اغلب برای فراهم کردن مقدار کافی DNA برای تعیین ژنوتیپ انجام شده و می‌تواند باعث "تاثیر نمونه گیری شانسی" (stochastic sampling effect) شود و منجر به حذف الل یا لوکوس یا حذف الل هتروزیگوت شده و تعیین ژنوتیپ را بسیار دشوار سازد. به عنوان یک راه کار Kelly Griesdale و Angela van Deel این فرضیه را مطرح کردند که تکثیر خطی مقادیر جزئی DNA الگو پیش از تکثیر PCR برای تعیین ژنوتیپ، می‌تواند میزان الگو را در مقایسه با تکثیر PCR معمولی به صورت قابل تشخیص تری افزایش دهد. با استفاده از این تکنیک آنها موفق شدند در مقایسه با تکنیک بدون تکثیر پیش از PCR، افزایش قابل توجهی در مقدار کلی الل‌های به دست آمده توسط تعیین ژنوتیپ STR از مقادیر بسیار جزئی DNA ژنومی‌ انسانی به دست آورند.

۴. برتری‌های استفاده از QIAsherdder در مقایسه با هضم آنزیمی ‌برای آماده سازی DNA در droplet digital PCR

به عنوان یکی از جدید ترین انواع PCR، تکنیک digital PCR به میزان بسیار زیادی برای تعیین مقدار توالی هدف محبوب شده است. یک نکته کلیدی در این تکنیک، تقسیم شدن مساوی نمونه DNA در بین بخش‌های متفاوت مانند چاهک‌های microfluidic یا microdroplet در روغن، پیش از PCR است. این در حالی است که اگر مقادیر بزرگتر DNA ژنومی‌ مورد استفاده قرار گیرد، چسبندگی (viscosity) بیشتر می‌تواند تقسیم شدن مساوی را تحت تاثیر قرار دهد. در چنین شرایطی شرکت‌های تولید کننده، معمولا هضم آنزیمی‌ نمونه DNA را پیش از مرحله تقسیم بندی پیشنهاد می‌کنند. اگرچه چنین واکنش‌هایی می‌توانند زمان بر باشند و لازم به ذکر است که بافر‌های این آنزیم‌ها نیز می‌توانند تاثیر منفی بر PCR بعد از خود داشته باشند. در مقاله ای که در ماه اردیبهشت به چاپ رسیده است Yukl و همکارانش نشان دادند که یک ستون میکرو سانتریفیوژی به نام QIAshredder که حاوی یک پلیمر زیستی بوده و چسبندگی را کاهش داده و DNA را برش می‌زند، می‌تواند به جای واکنش‌های آنزیمی ‌برای آماده سازی DNA ژنومی ‌مورد استفاده در droplet digital PCR یا ddPCR مورد استفاده قرار گرفته و سنجش تعداد کپی بیشتری را در مقادیر بالای DNA ورودی منجر شود. با در نظر گرفتن صرفه جویی در زمان و کاربر، این QIAshredder می‌تواند یک جایگزین بسیار ارزشمند برای واکنش‌های هضم آنزیمی ‌در آماده سازی DNA ژنومی‌ برای ddPCR باشد.

۵. سنجش مقداری همزمان رونوشت‌هایی که به صورت متفاوت ویرایش شده اند (alternatively spliced transcripts) در یک واکنش droplet digital PCR

یکی از کاربرد‌های digital PCR مقدار سنجی مقادیر مشابهی از mRNA‌هایی است که به صورت متفاوت از یک ژن ویرایش شده اند. دکتر Yun Ling Zheng و همکارانش در حال بررسی ۴ ویرایش متفاوت خاص از حدود ۲۰ محصول ویرایش شده متفاوت ژن رونوشت بردار معکوس تلومر انسانی (hTERT) بودند. این چهار رونوشت در وجود اگزون α و یا اگزون β متفاوت بوده و نشانگر‌های زیستی سرطان هستند زیرا در بسیاری از انواع سرطان دیده شده اند. بر مبنای اینکه اطلاعات پیشین در زمینه سنجش مقداری این چهار رونوشت ویرایش شده به دلیل مقدار کم بیان آنها (+α–/β+; α+/ β –; α–/ β –; α+/ β) به میزان کافی دارای حساسیت نیست، نویسندگان این مقاله تصمیم گرفتند که از droplet digital PCR استفاده کنند. همانطور که در مقاله ماه تیر این محققان تشریح شده است، آنها روشی را ابداع کرده اند که به طور همزمان حضور و یا فقدان اگزون‌های α و β را در یک واکنش ddPCR به ازاء انجام یک واکنش برای هر کدام از اگزون‌ها مورد سنجش قرار می‌دهد. با استفاده از تنها یک جفت پرایمر PCR و دو پروب هیدرولیزی با برچسب دوگانه فلوروسنت، Zheng و گروهش موفق شدند که به صورت مستقیم سطح بیان چهار ایزوفرم ویرایش شده را در یک واکنش بسنجند.

با در نظر گرفتن این پنج مقاله برتر در زمینه روش‌های PCR در سال ۲۰۱۴ بسیار امیدواریم که محققان در سال آینده نیز برای بهبود روش‌های PCR از کاربرد‌های ابتدایی گرفته تا تکنیک‌های پیشرفته مانند digital PCR تلاش کنند. اما به نظر شما با وجود پیشرفت‌های امروزی چه کمبود‌هایی در زمینه PCR حس می‌شود؟

منبع: BioTechniques